Spektrofotometri er en metode til at måle, hvor meget et kemisk stof absorberer lys ved at måle intensiteten af lys, når en lysstråle passerer gennem prøveopløsning. Det grundlæggende princip er, at hver forbindelse absorberer eller transmitterer lys over et bestemt bølgelængdeområde. Denne måling kan også bruges til at måle mængden af et kendt kemisk stof. Spektrofotometri er en af de mest nyttige metoder til kvantitativ analyse inden for forskellige områder såsom kemi, fysik, biokemi, materiale- og kemiteknik og kliniske anvendelser.

Introduktion

Enhver kemisk forbindelse absorberer, transmitterer eller reflekterer lys (elektromagnetisk stråling) over et bestemt bølgelængdeområde. Spektrofotometri er en måling af, hvor meget et kemisk stof absorberer eller transmitterer. Spektrofotometri bruges i vid udstrækning til kvantitativ analyse på forskellige områder (f.eks. kemi, fysik, biologi, biokemi, materiale- og kemiteknik, kliniske applikationer, industrielle applikationer osv.). Enhver applikation, der omhandler kemiske stoffer eller materialer, kan bruge denne teknik. I biokemi bruges det for eksempel til at bestemme enzymkatalyserede reaktioner. I kliniske applikationer bruges det til at undersøge blod eller væv til klinisk diagnose. Der er også flere variationer af spektrofotometrien, såsom atomabsorptionsspektrofotometri og atomemissionsspektrofotometri.

Et spektrofotometer er et instrument, der måler mængden af fotoner (intensiteten af lys), der absorberes, efter at det passerer gennem prøveopløsning. Med spektrofotometeret kan mængden af et kendt kemisk stof (koncentrationer) også bestemmes ved at måle intensiteten af det detekterede lys. Afhængig af lyskildens bølgelængdeområde kan den klassificeres i to forskellige typer:

• UV-synligt spektrofotometer : bruger lys over det ultraviolette område (185 – 400 nm) og det synlige område (400 – 700 nm) af elektromagnetisk strålingsspektrum.
• IR-spektrofotometer : bruger lys over det infrarøde område (700 – 15000 nm) af elektromagnetisk strålingsspektrum.

Ved synlig spektrofotometri kan absorptionen eller transmissionen af et bestemt stof bestemmes af den observerede farve. For eksempel ser en opløsningsprøve, der absorberer lys over alle synlige områder (dvs. ikke transmitterer nogen af de synlige bølgelængder), sort i teorien. På den anden side, hvis alle synlige bølgelængder transmitteres (dvs. ikke absorberer noget), fremstår opløsningsprøven hvid. Hvis en opløsningsprøve absorberer rødt lys (~700 nm), ser den grøn ud, fordi grøn er komplementærfarven til rød. Synlige spektrofotometre bruger i praksis et prisme til at indsnævre et bestemt bølgelængdeinterval (for at filtrere andre bølgelængder fra), så den særlige lysstråle passerer gennem en opløsningsprøve.

Enheder og mekanisme

Figur 1 illustrerer den grundlæggende struktur af spektrofotometre. Den består af en lyskilde, en kollimator, en monokromator, en bølgelængdevælger, en kuvette til prøveopløsning, en fotoelektrisk detektor og et digitalt display eller en måler. Detaljeret mekanisme er beskrevet nedenfor. Figur 2 viser et prøvespektrofotometer (model: Spectronic 20D).

Et spektrofotometer består generelt af to enheder; et spektrometer og et fotometer. Et spektrometer er en enhed, der producerer, spreder og måler lys. Et fotometer angiver den fotoelektriske detektor, der måler lysets intensitet.

• Spektrometer : Det producerer et ønsket bølgelængdeområde af lys. Først transmitterer en kollimator (linse) en lige stråle af lys (fotoner), der passerer gennem en monokromator (prisme) for at opdele den i flere komponentbølgelængder (spektrum). Så sender en bølgelængdevælger (spalte) kun de ønskede bølgelængder, som vist i figur 1.
• Fotometer : Efter det ønskede lysbølgelængdeområde er passeret gennem opløsningen af en prøve i kuvette, registrerer fotometeret mængden af fotoner, der absorberes, og sender derefter et signal til et galvanometer eller et digitalt display, som illustreret i figur 1.

Du har brug for et spektrometer til at producere en række bølgelængder, fordi forskellige forbindelser absorberer bedst ved forskellige bølgelængder. For eksempel har p-nitrophenol (syreform) den maksimale absorbans ved ca. 320 nm og p-nitrophenolat (basisform) absorberer bedst ved 400 nm, som vist i figur 3.

Ser man på grafen, der måler absorbans og bølgelængde, kan der også observeres et isosbestisk punkt. Et isosbestisk punkt er den bølgelængde, hvor absorbansen af to eller flere arter er den samme. Forekomsten af et isosbestisk punkt i en reaktion viser, at der IKKE kræves et mellemprodukt for at danne et produkt ud fra en reaktant. Figur 4 viser et eksempel på et isosbestisk punkt.

Med henvisning tilbage til figur 1 (og figur 5), er mængden af fotoner, der går gennem kuvetten og ind i detektoren, afhængig af kuvettens længde og koncentrationen af prøven. Når du kender intensiteten af lys, efter at det passerer gennem kuvetten, kan du relatere det til transmittans (T). Transmittans er den del af lys, der passerer gennem prøven. Dette kan beregnes ved hjælp af ligningen:

\(Transmittans (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Hvor I _t er lysintensiteten efter at lysstrålen passerer gennem kuvetten og I _o er lysintensiteten før lysstrålen passerer gennem kuvetten. Transmittans er relateret til absorption ved udtrykket:

\(Absorbans (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Hvor absorbans står for mængden af fotoner, der absorberes. Med mængden af absorbans kendt fra ovenstående ligning, kan du bestemme den ukendte koncentration af prøven ved at bruge Beer-Lambert Law. Figur 5 illustrerer transmittans af lys gennem en prøve. Længden \(l\) bruges til Beer-Lambert Law beskrevet nedenfor.

Øl-Lambert lov

Beer-Lambert Law (også kendt som Beers lov) siger, at der er et lineært forhold mellem absorbansen og koncentrationen af en prøve. Af denne grund kan Beers lov kun anvendes, når der er en lineær sammenhæng. Øls lov er skrevet som:

\(A = \epsilon{lc} \)

hvor

• \(A\) er målet for absorbans (ingen enheder),
• \(\epsilon\) er den molære ekstinktionskoefficient eller molære absorptionsevne (eller absorptionskoefficient),
• \(l\) er stiens længde, og
• \(c\) er koncentrationen.

Den molære ekstinktionskoefficient er angivet som en konstant og varierer for hvert molekyle. Da absorbans ikke bærer nogen enheder, skal enhederne for \(\epsilon\) udligne længde- og koncentrationsenhederne. Som et resultat har \(\epsilon\) enhederne: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Vejlængden måles i centimeter. Fordi et standardspektrometer bruger en kuvette, der er 1 cm i bredden, antages \(l\) altid at være lig med 1 cm. Da absorption, \(\epsilon\) og vejlængde er kendt, kan vi beregne koncentrationen \(c\) af prøven.

Eksempel 1

Guanosin har en maksimal absorbans på 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) og stiens længde er 1 cm. Ved hjælp af et spektrofotometer finder du, at \(A_{275} = 0,70\). Hvad er koncentrationen af guanosin?

Opløsning

For at løse dette problem skal du bruge Beers lov.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Derefter divideres begge sider med [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = ^8,33×10-5 mol/L

Eksempel 2

Der er et stof i en opløsning (4 g/liter). Kuvettens længde er 2 cm og kun 50 % af den bestemte lysstråle transmitteres. Hvad er absorptionskoefficienten?

Opløsning

Ved hjælp af Beer-Lambert Law kan vi beregne absorptionskoefficienten. Dermed,

\(- \log \venstre(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0,5}{1,0}) = A ={8} \epsilon\)

Så får vi det

\(\epsilon\) = 0,0376

Eksempel 3

I eksempel 2 ovenfor, hvor meget er lysstrålen transmitteret, når 8 g/liter?

Opløsning

Da vi kender \(\epsilon\), kan vi beregne transmissionen ved hjælp af Beer-Lambert Law. Dermed,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Derfor er \(I_t\) = 0,2503 = 25 %

Eksempel 4

I eksempel 2 ovenfor, hvad er den molære absorptionskoefficient, hvis molekylvægten er 100?

Opløsning

Det kan simpelthen opnås ved at gange absorptionskoefficienten med molekylvægten. Dermed,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Eksempel 5

Absorptionskoefficienten for et glykogen-jod-kompleks er 0,20 ved lys på 450 nm. Hvad er koncentrationen, når transmissionen er 40 % i en kuvette på 2 cm?

Opløsning

Det kan også løses ved hjælp af Beer-Lambert Law. Derfor,

\[- \log(I_t) = – \log(0,4) = 0,20 \ gange c \ gange 2\]

Så \(c\) = 0,9948

Referencer

1. Atkins, Peter og Julio de Paula. Fysisk kemi for biovidenskaberne. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Fysisk kemi for biovidenskaberne. USA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrofotometri & Spektrofluorimetri. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas og Dwek, Raymond og Wormald, Mark. Principper og problemer i fysisk kemi for biokemikere. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. udgave, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Bidragydere og tilskrivninger

• Kevin Vo (UCD)

Kilde