Inden for molekylære og biokemiske anvendelser, såvel som inden for medicinsk diagnostik, er bestemmelse af koncentrationerne af stoffer i opløsning et afgørende analysetrin. Ofte anvendes fotometriske metoder til dette formål, da disse kan udføres nemt og hurtigt, og fordi de ofte repræsenterer den mest omkostningseffektive løsning.

Generelt er (spektro)fotometriske metoder baseret på princippet om, at molekyler i opløsning absorberer lys, og at det dermed svækkede lys måles ved hjælp af en detektor. Som antydet i navnet bruger UV/Vis-spektrofotometre synligt og ultraviolet lys i bølgelængdeområdet mellem ca. 200 og 900 nm.

For at bestemme koncentrationen af en analyt anvendes oftest den bølgelængde, hvor molekylet udviser den højeste absorbans (peak-bølgelængde). I tilfælde af nukleinsyrer og proteiner vil dette for eksempel være henholdsvis 260 nm og 280 nm. Fysikkens love beskrevet af Lambert-Beer-loven danner grundlag for beregningen af koncentrationen af et stof ud fra fotometriske målinger. Dette sker i henhold til trinene i formlerne nedenfor:

1. Transmission eller transmission (T) = I/I ₀
   Transmissionen bestemmes i et fotometer ved at bruge forholdet mellem det lys, der kommer ud, og det lys, der kommer ind i prøven.
2. Absorbans (A) = log (I ₀ /I)
   Absorbans beregnes ud fra den negative dekadiske logaritme for transmission.
3. Absorbans (A) = C x L x Ɛ => Koncentration (C) = A/(L x Ɛ)
   Lambert-Beer-loven beskriver absorbansens afhængighed af koncentrationen af prøven (C), den optiske vejlængde (L) samt afhængigheden af en prøvespecifik ekstinktionskoefficient (Ɛ), som vedrører et specifikt stof ved en bestemt bølgelængde. Prøvekoncentrationen beregnes derefter ved at konvertere formlen.

Disse tre udsagn er beskrevet mere detaljeret nedenfor.

Bestemmelse af transmission (T = I/I ₀ )

I ₀ : Lys, der kommer ind i prøven
I: Lys, der forlader prøven
C: Koncentration af prøven
L: Prøvens lysbane/tykkelse
Ɛ: Ekstinktionskoefficient

Grundlæggende består et fotometer af en lyskilde, en position som holder prøven og en detektor (figur 1). Detektoren måler intensiteten af lyset, der bevæger sig gennem prøven. Naturligvis er en række andre komponenter til stede; specifikt optiske elementer, som bryder lyset og adskiller det i individuelle bølgelængder samt elementer, der reflekterer eller transmitterer lyset.

Lyskilden i et fotometer udsender lys med en defineret intensitet I ₀ , som ledes gennem prøveopløsningen. En del af lyset vil blive absorberet af prøven. Den del, der passerer prøven, registreres af detektoren som intensitet I. Forholdet I/I ₀ beskriver transmissionen af prøven ved en defineret bølgelængde.

Beregning af absorbans (A = log (I ₀ /I)

Moderne fotometre konverterer automatisk transmissionen af en prøve til absorbans, som er defineret som den negative dekadiske logaritme for transmission. Spørgsmålet opstår, hvorfor transmission ikke direkte bruges til beregning af prøvekoncentration. Figur 2 tydeliggør sammenhængen mellem transmission og absorbans. Hvis flere prøver, som hver tillader 50 % af det lys, der kommer ind i prøven at passere, er forbundet i serie, vil den eksponentielt faldende transmissionskurve, som er afbildet nedenfor, resultere. Hvis værdierne i stedet udtrykkes på en logaritmisk måde, vil en lineær afhængighed resultere. På denne måde er absorbans proportional med koncentration (samt vejlængde), hvilket forenkler beregningerne betydeligt.

Figur 2: Forbindelsen mellem transmission og absorbans af lys:

Beregning af koncentration (C = A/(L x Ɛ))

For at udlede koncentrationen af en prøve ud fra dens absorbans kræves yderligere information. Lambert-Beer-loven, som danner det fysiske grundlag for fotometriske anvendelser, beskriver, at en prøves absorption af lys er direkte proportional med dens koncentration og dens vejlængde. I alt bidrager tre parametre til absorbansværdien af en prøve: for det første koncentrationen (C) af molekylet; for det andet prøvens vejlængde (L), som generelt er lig med kuvettens vejlængde. Så er der ekstinktionskoefficienten (Ɛ). Ekstinktionskoefficienten er en fysisk konstant, der er unik for molekylet; den beskriver dens egenskab ved at absorbere lys ved en bestemt bølgelængde. Denne materialespecifikke konstant er kendt for en række stoffer, herunder nukleinsyrer og forskellige proteiner, og værdierne er publiceret i den relevante litteratur. I disse tilfælde kan koncentrationen bestemmes øjeblikkeligt. Hvis værdien ikke kendes, er det dog muligt at få hjælp af en kalibreringskurve. For at skabe en kalibreringskurve kræves standarder, dvs. opløsninger, som indeholder kendte koncentrationer af de stoffer, der skal analyseres. Disse måles i fotometeret før den faktiske prøve. Koncentrationen af analytten beregnes derefter ved hjælp af standardkurven.

Ud over kvantificering kan absorbansmålinger også afsløre kvalitativ information om prøven: for eksempel kan renheden af nukleinsyrer og proteiner bestemmes ved at udsætte prøven for målinger ved yderligere bølgelængder, hvorimod information om enzymaktivitet generelt opnås gennem gentagne målinger over tid.

Kilde