La spectrophotométrie est une méthode permettant de mesurer la quantité de lumière absorbée par une substance chimique en mesurant l’intensité de la lumière lorsqu’un faisceau de lumière traverse une solution d’échantillon. Le principe de base est que chaque composé absorbe ou transmet la lumière sur une certaine plage de longueur d’onde. Cette mesure peut également être utilisée pour mesurer la quantité d’une substance chimique connue. La spectrophotométrie est l’une des méthodes d’analyse quantitative les plus utiles dans divers domaines tels que la chimie, la physique, la biochimie, le génie des matériaux et la chimie et les applications cliniques.

introduction

Chaque composé chimique absorbe, transmet ou réfléchit la lumière (rayonnement électromagnétique) sur une certaine gamme de longueurs d’onde. La spectrophotométrie est une mesure de la quantité d’absorption ou de transmission d’une substance chimique. La spectrophotométrie est largement utilisée pour l’analyse quantitative dans divers domaines (par exemple, chimie, physique, biologie, biochimie, génie des matériaux et chimique, applications cliniques, applications industrielles, etc.). Toute application traitant de substances ou de matériaux chimiques peut utiliser cette technique. En biochimie, par exemple, il est utilisé pour déterminer les réactions catalysées par les enzymes. Dans les applications cliniques, il est utilisé pour examiner le sang ou les tissus à des fins de diagnostic clinique. Il existe également plusieurs variantes de la spectrophotométrie telles que la spectrophotométrie d’absorption atomique et la spectrophotométrie d’émission atomique.

Un spectrophotomètre est un instrument qui mesure la quantité de photons (l’intensité de la lumière) absorbée après son passage à travers la solution échantillon. Avec le spectrophotomètre, la quantité d’une substance chimique connue (concentrations) peut également être déterminée en mesurant l’intensité de la lumière détectée. Selon la gamme de longueur d’onde de la source lumineuse, elle peut être classée en deux types différents :

• Spectrophotomètre UV-visible : utilise la lumière sur la gamme ultraviolette (185 – 400 nm) et la gamme visible (400 – 700 nm) du spectre de rayonnement électromagnétique.
• Spectrophotomètre IR : utilise la lumière dans la gamme infrarouge (700 – 15000 nm) du spectre de rayonnement électromagnétique.

En spectrophotométrie visible, l’absorption ou la transmission d’une certaine substance peut être déterminée par la couleur observée. Par exemple, un échantillon de solution qui absorbe la lumière sur toutes les gammes visibles (c’est-à-dire, ne transmet aucune des longueurs d’onde visibles) apparaît noir en théorie. D’autre part, si toutes les longueurs d’onde visibles sont transmises (c’est-à-dire qu’elles n’absorbent rien), l’échantillon de solution apparaît blanc. Si un échantillon de solution absorbe la lumière rouge (~ 700 nm), il apparaît vert car le vert est la couleur complémentaire du rouge. Les spectrophotomètres visibles, en pratique, utilisent un prisme pour réduire une certaine gamme de longueurs d’onde (pour filtrer d’autres longueurs d’onde) afin que le faisceau de lumière particulier passe à travers un échantillon de solution.

Dispositifs et mécanisme

La figure 1 illustre la structure de base des spectrophotomètres. Il se compose d’une source lumineuse, d’un collimateur, d’un monochromateur, d’un sélecteur de longueur d’onde, d’une cuvette pour la solution d’échantillon, d’un détecteur photoélectrique et d’un affichage numérique ou d’un compteur. Le mécanisme détaillé est décrit ci-dessous. La figure 2 montre un échantillon de spectrophotomètre (modèle : Spectronic 20D).

Un spectrophotomètre, en général, se compose de deux appareils ; un spectromètre et un photomètre. Un spectromètre est un appareil qui produit, disperse et mesure généralement la lumière. Un photomètre désigne le détecteur photoélectrique qui mesure l’intensité de la lumière.

• Spectromètre : Il produit une gamme souhaitée de longueur d’onde de lumière. Tout d’abord, un collimateur (lentille) transmet un faisceau droit de lumière (photons) qui traverse un monochromateur (prisme) pour le diviser en plusieurs longueurs d’onde composantes (spectre). Ensuite, un sélecteur de longueur d’onde (fente) ne transmet que les longueurs d’onde souhaitées, comme illustré à la figure 1.
• Photomètre : Après que la gamme souhaitée de longueur d’onde de lumière traverse la solution d’un échantillon dans une cuvette, le photomètre détecte la quantité de photons qui est absorbée, puis envoie un signal à un galvanomètre ou à un affichage numérique, comme illustré à la figure 1.

Vous avez besoin d’un spectromètre pour produire une variété de longueurs d’onde car différents composés absorbent mieux à différentes longueurs d’onde. Par exemple, le p-nitrophénol (forme acide) a l’absorbance maximale à environ 320 nm et le p-nitrophénolate (forme basique) absorbe mieux à 400 nm, comme le montre la figure 3.

En regardant le graphique qui mesure l’absorbance et la longueur d’onde, un point isobestique peut également être observé. Un point isobestique est la longueur d’onde dans laquelle l’absorbance de deux espèces ou plus est la même. L’apparition d’un point isobestique dans une réaction démontre qu’un intermédiaire n’est PAS nécessaire pour former un produit à partir d’un réactif. La figure 4 montre un exemple de point isobestique.

En se référant à la figure 1 (et à la figure 5), la quantité de photons qui traverse la cuvette et dans le détecteur dépend de la longueur de la cuvette et de la concentration de l’échantillon. Une fois que vous connaissez l’intensité de la lumière après son passage dans la cuvette, vous pouvez la relier à la transmission (T). La transmittance est la fraction de lumière qui traverse l’échantillon. Cela peut être calculé à l’aide de l’équation :

\(Transmittance (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Où I _t est l’intensité lumineuse après que le faisceau lumineux traverse la cuvette et I _o est l’intensité lumineuse avant que le faisceau lumineux traverse la cuvette. La transmittance est liée à l’absorption par l’expression :

\(Absorbance (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Où l’absorbance représente la quantité de photons qui est absorbée. Avec la quantité d’absorbance connue à partir de l’équation ci-dessus, vous pouvez déterminer la concentration inconnue de l’échantillon en utilisant la loi de Beer-Lambert. La figure 5 illustre la transmission de la lumière à travers un échantillon. La longueur \(l\) est utilisée pour la loi de Beer-Lambert décrite ci-dessous.

Loi Beer-Lambert

La loi de Beer-Lambert (également connue sous le nom de loi de Beer) stipule qu’il existe une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration d’un échantillon. Pour cette raison, la loi de Beer ne peut être appliquée que lorsqu’il existe une relation linéaire. La loi de Beer s’écrit :

\(A = \epsilon{lc} \)

où

• \(A\) est la mesure de l’absorbance (pas d’unités),
• \(\epsilon\) est le coefficient d’extinction molaire ou l’absorptivité molaire (ou coefficient d’absorption),
• \(l\) est la longueur du chemin, et
• \(c\) est la concentration.

Le coefficient d’extinction molaire est donné sous forme de constante et varie pour chaque molécule. Puisque l’absorbance ne porte aucune unité, les unités pour \(\epsilon\) doivent annuler les unités de longueur et de concentration. Par conséquent, \(\epsilon\) a pour unités : L·mol ^-1 ·cm ^-1 . La longueur du trajet est mesurée en centimètres. Étant donné qu’un spectromètre standard utilise une cuvette de 1 cm de largeur, \(l\) est toujours supposé égal à 1 cm. Puisque l’absorption, \(\epsilon\) et la longueur du trajet sont connues, nous pouvons calculer la concentration \(c\) de l’échantillon.

Exemple 1

La guanosine a une absorbance maximale de 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) et la longueur du chemin est de 1 cm. À l’aide d’un spectrophotomètre, vous trouvez que \(A_{275} = 0,70\). Quelle est la concentration de guanosine ?

Solution

Pour résoudre ce problème, vous devez utiliser la loi de Beer.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Ensuite, divisez les deux côtés par [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33×10 ^-5 mol/L

Exemple 2

Il y a une substance dans une solution (4 g/litre). La longueur de la cuvette est de 2 cm et seulement 50% du certain faisceau lumineux est transmis. Qu’est-ce que le coefficient d’absorption ?

Solution

En utilisant la loi de Beer-Lambert, nous pouvons calculer le coefficient d’absorption. Ainsi,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = UNE ={8} \epsilon\)

On obtient alors que

\(\epsilon\) = 0,0376

Exemple 3

Dans l’exemple 2 ci-dessus, combien le faisceau lumineux est-il transmis lorsque 8 g/litre ?

Solution

Puisque nous connaissons \(\epsilon\), nous pouvons calculer la transmission en utilisant la loi de Beer-Lambert. Ainsi,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Par conséquent, \(I_t\) = 0,2503 = 25 %

Exemple 4

Dans l’exemple 2 ci-dessus, quel est le coefficient d’absorption molaire si le poids moléculaire est de 100 ?

Solution

Il peut simplement être obtenu en multipliant le coefficient d’absorption par le poids moléculaire. Ainsi,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Exemple 5

Le coefficient d’absorption d’un complexe glycogène-iode est de 0,20 à la lumière de 450 nm. Quelle est la concentration lorsque la transmission est de 40 % dans une cuvette de 2 cm ?

Solution

Il peut également être résolu en utilisant la loi de Beer-Lambert. Donc,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Alors \(c\) = 0,9948

Les références

1. Atkins, Peter et Julio de Paula. Physico-chimie pour les sciences du vivant. New York : Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Physico-chimie pour les biosciences. États-Unis: University Science Books, 2005.
3. Goré, Michael. Spectrophotométrie & Spectrofluorimétrie. New York : Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas et Dwek, Raymond et Wormald, Mark. Principes et problèmes de chimie physique pour les biochimistes. RG Ratcliffe. New York : Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Calculs biochimiques (Comment résoudre des problèmes mathématiques en biochimie générale), 2e édition, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Contributeurs et attributions

• Kevin Vo (UCD)

La source