Spektrofotometri är en metod för att mäta hur mycket ett kemiskt ämne absorberar ljus genom att mäta ljusets intensitet när en ljusstråle passerar genom provlösningen. Grundprincipen är att varje förening absorberar eller överför ljus över ett visst våglängdsområde. Denna mätning kan också användas för att mäta mängden av ett känt kemiskt ämne. Spektrofotometri är en av de mest användbara metoderna för kvantitativ analys inom olika områden som kemi, fysik, biokemi, material- och kemiteknik och kliniska tillämpningar.

Introduktion

Varje kemisk förening absorberar, överför eller reflekterar ljus (elektromagnetisk strålning) över ett visst våglängdsområde. Spektrofotometri är ett mått på hur mycket ett kemiskt ämne absorberar eller överför. Spektrofotometri används ofta för kvantitativ analys inom olika områden (t.ex. kemi, fysik, biologi, biokemi, material- och kemiteknik, kliniska tillämpningar, industriella tillämpningar, etc). Alla applikationer som handlar om kemiska ämnen eller material kan använda denna teknik. Inom biokemi, till exempel, används det för att bestämma enzymkatalyserade reaktioner. I kliniska tillämpningar används det för att undersöka blod eller vävnader för klinisk diagnos. Det finns också flera varianter av spektrofotometri såsom atomabsorptionsspektrofotometri och atomemissionsspektrofotometri.

En spektrofotometer är ett instrument som mäter mängden fotoner (intensiteten av ljus) som absorberas efter att det passerat genom provlösningen. Med spektrofotometern kan mängden av ett känt kemiskt ämne (koncentrationer) också bestämmas genom att mäta intensiteten av det detekterade ljuset. Beroende på ljuskällans våglängdsområde kan den delas in i två olika typer:

• UV-synlig spektrofotometer : använder ljus över det ultravioletta området (185 – 400 nm) och det synliga området (400 – 700 nm) av elektromagnetiskt strålningsspektrum.
• IR-spektrofotometer : använder ljus över det infraröda området (700 – 15000 nm) av elektromagnetiskt strålningsspektrum.

I synlig spektrofotometri kan absorptionen eller överföringen av ett visst ämne bestämmas av den observerade färgen. Till exempel, ett lösningsprov som absorberar ljus över alla synliga områden (dvs. sänder ingen av synliga våglängder) verkar svart i teorin. Å andra sidan, om alla synliga våglängder sänds ut (dvs. absorberar ingenting), ser lösningsprovet vitt ut. Om ett lösningsprov absorberar rött ljus (~700 nm) ser det grönt ut eftersom grönt är komplementfärgen till rött. Synliga spektrofotometrar använder i praktiken ett prisma för att begränsa ett visst våglängdsområde (för att filtrera bort andra våglängder) så att den speciella ljusstrålen passerar genom ett lösningsprov.

Enheter och mekanism

Figur 1 illustrerar den grundläggande strukturen för spektrofotometrar. Den består av en ljuskälla, en kollimator, en monokromator, en våglängdsväljare, en kyvett för provlösning, en fotoelektrisk detektor och en digital display eller en mätare. Detaljerad mekanism beskrivs nedan. Figur 2 visar en provspektrofotometer (modell: Spectronic 20D).

En spektrofotometer består i allmänhet av två enheter; en spektrometer och en fotometer. En spektrometer är en enhet som producerar, vanligtvis sprider och mäter ljus. En fotometer indikerar den fotoelektriska detektorn som mäter ljusets intensitet.

• Spektrometer : Den producerar ett önskat våglängdsområde för ljus. Först sänder en kollimator (lins) en rak ljusstråle (fotoner) som passerar genom en monokromator (prisma) för att dela upp den i flera komponentvåglängder (spektrum). Sedan sänder en våglängdsväljare (slits) endast de önskade våglängderna, som visas i figur 1.
• Fotometer : Efter det önskade våglängdsområdet för ljuset passerar genom lösningen av ett prov i kyvett, detekterar fotometern mängden fotoner som absorberas och skickar sedan en signal till en galvanometer eller en digital display, som illustreras i figur 1.

Du behöver en spektrometer för att producera en mängd olika våglängder eftersom olika föreningar absorberar bäst vid olika våglängder. Till exempel har p-nitrofenol (syraform) den maximala absorbansen vid cirka 320 nm och p-nitrofenolat (basform) absorberar bäst vid 400 nm, som visas i figur 3.

Om man tittar på grafen som mäter absorbans och våglängd kan man också observera en isobestisk punkt. En isobestisk punkt är den våglängd där absorbansen för två eller flera arter är densamma. Uppkomsten av en isosbestisk punkt i en reaktion visar att en mellanprodukt INTE krävs för att bilda en produkt från en reaktant. Figur 4 visar ett exempel på en isobestisk punkt.

Med hänvisning tillbaka till figur 1 (och figur 5), är mängden fotoner som går genom kyvetten och in i detektorn beroende på kyvettens längd och koncentrationen av provet. När du väl vet intensiteten av ljus efter att det passerat genom kyvetten kan du relatera det till transmittans (T). Transmittans är den del av ljuset som passerar genom provet. Detta kan beräknas med hjälp av ekvationen:

\(Transmittans (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Där I _t är ljusintensiteten efter att ljusstrålen passerat genom kyvetten och I _o är ljusintensiteten innan ljusstrålen passerar genom kyvetten. Transmittans är relaterad till absorption genom uttrycket:

\(Absorbans (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Där absorbans står för mängden fotoner som absorberas. Med mängden absorbans känd från ovanstående ekvation, kan du bestämma den okända koncentrationen av provet genom att använda Beer-Lambert Law. Figur 5 illustrerar transmittans av ljus genom ett prov. Längden \(l\) används för Beer-Lambert Law som beskrivs nedan.

Beer-Lambert lag

Beer-Lambert Law (även känd som Beer’s Law) säger att det finns ett linjärt samband mellan absorbansen och koncentrationen av ett prov. Av denna anledning kan Beers lag endast tillämpas när det finns ett linjärt samband. Beers lag är skrivet som:

\(A = \epsilon{lc} \)

var

• \(A\) är måttet på absorbans (inga enheter),
• \(\epsilon\) är den molära extinktionskoefficienten eller den molära absorptionsförmågan (eller absorptionskoefficienten),
• \(l\) är väglängden, och
• \(c\) är koncentrationen.

Den molära extinktionskoefficienten anges som en konstant och varierar för varje molekyl. Eftersom absorbansen inte bär några enheter, måste enheterna för \(\epsilon\) ta bort enheterna för längd och koncentration. Som ett resultat har \(\epsilon\) enheterna: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Banlängden mäts i centimeter. Eftersom en standardspektrometer använder en kyvett som är 1 cm bred, antas \(l\) alltid vara lika med 1 cm. Eftersom absorption, \(\epsilon\), och väglängd är kända, kan vi beräkna koncentrationen \(c\) av provet.

Exempel 1

Guanosin har en maximal absorbans på 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) och banlängden är 1 cm. Med hjälp av en spektrofotometer hittar du det \(A_{275} = 0,70\). Vad är koncentrationen av guanosin?

Lösning

För att lösa detta problem måste du använda Beer’s Law.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Dela sedan båda sidor med [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = ^8,33×10-5 mol/L

Exempel 2

Det finns ett ämne i en lösning (4 g/liter). Kyvettens längd är 2 cm och endast 50 % av den bestämda ljusstrålen sänds ut. Vad är absorptionskoefficienten?

Lösning

Med Beer-Lambert Law kan vi beräkna absorptionskoefficienten. Således,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epsilon\)

Då får vi det

\(\epsilon\) = 0,0376

Exempel 3

I exempel 2 ovan, hur mycket är ljusstrålen som sänds ut när 8 g/liter?

Lösning

Eftersom vi vet \(\epsilon\), kan vi beräkna transmissionen med Beer-Lambert Law. Således,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Därför är \(I_t\) = 0,2503 = 25 %

Exempel 4

I exempel 2 ovan, vad är den molära absorptionskoefficienten om molekylvikten är 100?

Lösning

Det kan enkelt erhållas genom att multiplicera absorptionskoefficienten med molekylvikten. Således,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Exempel 5

Absorptionskoefficienten för ett glykogen-jodkomplex är 0,20 vid ljus av 450 nm. Vad är koncentrationen när transmissionen är 40 % i en kyvett på 2 cm?

Lösning

Det kan också lösas med Beer-Lambert Law. Därför,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \ gånger c \ gånger 2\]

Sedan \(c\) = 0,9948

Referenser

1. Atkins, Peter och Julio de Paula. Fysikalisk kemi för livsvetenskaperna. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Fysikalisk kemi för biovetenskaperna. USA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrofotometri & Spektrofluorimetri. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas och Dwek, Raymond och Wormald, Mark. Principer och problem i fysikalisk kemi för biokemister. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2:a upplagan, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Bidragsgivare och tillskrivningar

• Kevin Vo (UCD)

Källa