La spettrofotometria è un metodo per misurare la quantità di luce che una sostanza chimica assorbe misurando l’intensità della luce mentre un raggio di luce passa attraverso la soluzione campione. Il principio di base è che ogni composto assorbe o trasmette luce su un certo intervallo di lunghezza d’onda. Questa misurazione può essere utilizzata anche per misurare la quantità di una sostanza chimica nota. La spettrofotometria è uno dei metodi più utili di analisi quantitativa in vari campi come chimica, fisica, biochimica, ingegneria dei materiali e chimica e applicazioni cliniche.

introduzione

Ogni composto chimico assorbe, trasmette o riflette la luce (radiazioni elettromagnetiche) su un certo intervallo di lunghezza d’onda. La spettrofotometria è una misura di quanto una sostanza chimica assorbe o trasmette. La spettrofotometria è ampiamente utilizzata per l’analisi quantitativa in vari settori (ad es. chimica, fisica, biologia, biochimica, ingegneria dei materiali e chimica, applicazioni cliniche, applicazioni industriali, ecc.). Qualsiasi applicazione che si occupa di sostanze o materiali chimici può utilizzare questa tecnica. In biochimica, ad esempio, viene utilizzato per determinare le reazioni catalizzate da enzimi. Nelle applicazioni cliniche, viene utilizzato per esaminare sangue o tessuti per la diagnosi clinica. Esistono anche diverse varianti della spettrofotometria come la spettrofotometria di assorbimento atomico e la spettrofotometria di emissione atomica.

Uno spettrofotometro è uno strumento che misura la quantità di fotoni (l’intensità della luce) assorbita dopo che è passata attraverso la soluzione campione. Con lo spettrofotometro è anche possibile determinare la quantità di una sostanza chimica nota (concentrazioni) misurando l’intensità della luce rilevata. A seconda della gamma di lunghezza d’onda della sorgente luminosa, può essere classificata in due diversi tipi:

• Spettrofotometro UV-visibile : utilizza la luce nell’intervallo ultravioletto (185 – 400 nm) e nell’intervallo visibile (400 – 700 nm) dello spettro della radiazione elettromagnetica.
• Spettrofotometro IR : utilizza la luce nell’intervallo infrarosso (700 – 15000 nm) dello spettro della radiazione elettromagnetica.

Nella spettrofotometria visibile, l’assorbimento o la trasmissione di una certa sostanza può essere determinato dal colore osservato. Ad esempio, un campione di soluzione che assorbe la luce su tutte le gamme visibili (cioè, non trasmette nessuna delle lunghezze d’onda visibili) in teoria appare nero. D’altra parte, se tutte le lunghezze d’onda visibili vengono trasmesse (cioè non assorbe nulla), il campione di soluzione appare bianco. Se un campione di soluzione assorbe luce rossa (~700 nm), appare verde perché il verde è il colore complementare del rosso. Gli spettrofotometri visibili, in pratica, utilizzano un prisma per restringere un certo intervallo di lunghezze d’onda (per filtrare altre lunghezze d’onda) in modo che il particolare fascio di luce venga fatto passare attraverso un campione di soluzione.

Dispositivi e meccanismo

La figura 1 illustra la struttura di base degli spettrofotometri. È costituito da una sorgente luminosa, un collimatore, un monocromatore, un selettore di lunghezza d’onda, una cuvetta per la soluzione campione, un rivelatore fotoelettrico e un display digitale o un misuratore. Il meccanismo dettagliato è descritto di seguito. La figura 2 mostra uno spettrofotometro campione (modello: Spectronic 20D).

Uno spettrofotometro, in generale, è costituito da due dispositivi; uno spettrometro e un fotometro. Uno spettrometro è un dispositivo che produce, in genere disperde e misura la luce. Un fotometro indica il rivelatore fotoelettrico che misura l’intensità della luce.

• Spettrometro : produce una gamma di lunghezza d’onda della luce desiderata. Innanzitutto un collimatore (lente) trasmette un raggio di luce rettilineo (fotoni) che passa attraverso un monocromatore (prisma) per dividerlo in diverse lunghezze d’onda componenti (spettro). Quindi un selettore di lunghezza d’onda (fessura) trasmette solo le lunghezze d’onda desiderate, come mostrato nella Figura 1.
• Fotometro : dopo che l’intervallo di lunghezza d’onda della luce desiderato è passato attraverso la soluzione di un campione in cuvetta, il fotometro rileva la quantità di fotoni che viene assorbita e quindi invia un segnale a un galvanometro o a un display digitale, come illustrato nella Figura 1.

È necessario uno spettrometro per produrre una varietà di lunghezze d’onda perché diversi composti assorbono meglio a diverse lunghezze d’onda. Ad esempio, il p-nitrofenolo (forma acida) ha l’assorbimento massimo a circa 320 nm e il p-nitrofenolato (forma base) si assorbe meglio a 400 nm, come mostrato nella Figura 3.

Osservando il grafico che misura l’assorbanza e la lunghezza d’onda, si può anche osservare un punto isosbestico. Un punto isosbestico è la lunghezza d’onda in cui l’assorbanza di due o più specie è la stessa. La comparsa di un punto isosbestico in una reazione dimostra che NON è necessario un intermedio per formare un prodotto da un reagente. La figura 4 mostra un esempio di punto isosbestico.

Facendo riferimento alla Figura 1 (e alla Figura 5), la quantità di fotoni che passa attraverso la cuvetta e nel rivelatore dipende dalla lunghezza della cuvetta e dalla concentrazione del campione. Una volta che conosci l’intensità della luce dopo che è passata attraverso la cuvetta, puoi metterla in relazione con la trasmittanza (T). La trasmittanza è la frazione di luce che passa attraverso il campione. Questo può essere calcolato usando l’equazione:

\(Trasmittanza (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

_Dove I è l’intensità della luce dopo che il raggio di luce è passato attraverso la cuvetta e I _o è l’intensità della luce prima che il raggio di luce attraversi la cuvetta. La trasmittanza è correlata all’assorbimento da parte dell’espressione:

\(Assorbanza (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Dove assorbanza sta per la quantità di fotoni che viene assorbita. Con la quantità di assorbanza nota dall’equazione sopra, è possibile determinare la concentrazione sconosciuta del campione utilizzando la legge di Beer-Lambert. La figura 5 illustra la trasmissione della luce attraverso un campione. La lunghezza \(l\) viene utilizzata per la legge Beer-Lambert descritta di seguito.

Legge Birra-Lambert

Beer-Lambert Law (nota anche come Beer’s Law) afferma che esiste una relazione lineare tra l’assorbanza e la concentrazione di un campione. Per questo motivo, la legge di Beer può essere applicata solo quando esiste una relazione lineare. La legge della birra è scritta come:

\(LA = \epsilon{lc} \)

dove

• \(A\) è la misura dell’assorbanza (nessuna unità),
• \(\epsilon\) è il coefficiente di estinzione molare o assorbimento molare (o coefficiente di assorbimento),
• \(l\) è la lunghezza del percorso, e
• \(c\) è la concentrazione.

Il coefficiente di estinzione molare è dato come costante e varia per ciascuna molecola. Poiché l’assorbanza non trasporta alcuna unità, le unità per \(\epsilon\) devono annullare le unità di lunghezza e concentrazione. Di conseguenza, \(\epsilon\) ha le unità: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . La lunghezza del percorso è misurata in centimetri. Poiché uno spettrometro standard utilizza una cuvetta larga 1 cm, si presume che \(l\) sia sempre uguale a 1 cm. Poiché l’assorbimento, \(\epsilon\) e la lunghezza del percorso sono noti, possiamo calcolare la concentrazione \(c\) del campione.

Esempio 1

La guanosina ha un’assorbanza massima di 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) e la lunghezza del percorso è 1 cm. Usando uno spettrofotometro, trovi che \(A_{275} = 0,70\). Qual è la concentrazione di guanosina?

Soluzione

Per risolvere questo problema, devi usare la legge di Beer.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Quindi, dividi entrambi i lati per [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33×10 ^-5 mol/L

Esempio 2

C’è una sostanza in una soluzione (4 g/litro). La lunghezza della cuvetta è di 2 cm e viene trasmesso solo il 50% di un determinato raggio di luce. Qual è il coefficiente di assorbimento?

Soluzione

Usando la legge di Beer-Lambert, possiamo calcolare il coefficiente di assorbimento. Così,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epsilon\)

Quindi lo otteniamo

\(\epsilon\) = 0,0376

Esempio 3

Nell’esempio 2 sopra, quanto viene trasmesso il raggio di luce quando 8 g/litro ?

Soluzione

Poiché conosciamo \(\epsilon\), possiamo calcolare la trasmissione usando la legge di Beer-Lambert. Così,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Pertanto, \(I_t\) = 0,2503 = 25%

Esempio 4

Nell’esempio 2 sopra, qual è il coefficiente di assorbimento molare se il peso molecolare è 100?

Soluzione

Si ottiene semplicemente moltiplicando il coefficiente di assorbimento per il peso molecolare. Così,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Esempio 5

Il coefficiente di assorbimento di un complesso glicogeno-iodio è 0,20 alla luce di 450 nm. Qual è la concentrazione quando la trasmissione è del 40 % in una cuvetta di 2 cm?

Soluzione

Può anche essere risolto usando la legge Beer-Lambert. Perciò,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Allora \(c\) = 0,9948

Riferimenti

1. Atkins, Peter e Julio de Paula. Chimica fisica per le scienze della vita. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Chimica fisica per le bioscienze. USA: University Science Books, 2005.
3. Accidenti, Michele. Spettrofotometria e spettrofluorimetria. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas e Dwek, Raymond e Wormald, Mark. Principi e problemi di chimica fisica per i biochimici. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Calcoli biochimici (Come risolvere i problemi matematici nella biochimica generale), 2a edizione, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Contributi e attribuzioni

• Kevin Vo (UCD)

Fonte