La espectrofotometría es un método para medir la cantidad de luz que una sustancia química absorbe al medir la intensidad de la luz cuando un haz de luz pasa a través de una solución de muestra. El principio básico es que cada compuesto absorbe o transmite luz en un cierto rango de longitud de onda. Esta medida también se puede utilizar para medir la cantidad de una sustancia química conocida. La espectrofotometría es uno de los métodos más útiles de análisis cuantitativo en varios campos como la química, la física, la bioquímica, la ingeniería química y de materiales y las aplicaciones clínicas.

Introducción

Cada compuesto químico absorbe, transmite o refleja luz (radiación electromagnética) en un cierto rango de longitud de onda. La espectrofotometría es una medida de cuánto absorbe o transmite una sustancia química. La espectrofotometría se usa ampliamente para el análisis cuantitativo en diversas áreas (p. ej., química, física, biología, bioquímica, ingeniería química y de materiales, aplicaciones clínicas, aplicaciones industriales, etc.). Cualquier aplicación que trate con sustancias o materiales químicos puede utilizar esta técnica. En bioquímica, por ejemplo, se utiliza para determinar reacciones catalizadas por enzimas. En aplicaciones clínicas, se utiliza para examinar sangre o tejidos para el diagnóstico clínico. También hay varias variaciones de la espectrofotometría, como la espectrofotometría de absorción atómica y la espectrofotometría de emisión atómica.

Un espectrofotómetro es un instrumento que mide la cantidad de fotones (la intensidad de la luz) absorbidos después de pasar a través de la solución de muestra. Con el espectrofotómetro, también se puede determinar la cantidad de una sustancia química conocida (concentraciones) midiendo la intensidad de la luz detectada. Dependiendo del rango de longitud de onda de la fuente de luz, se puede clasificar en dos tipos diferentes:

• Espectrofotómetro UV-visible : utiliza luz en el rango ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) del espectro de radiación electromagnética.
• Espectrofotómetro IR : utiliza luz en el rango infrarrojo (700 – 15000 nm) del espectro de radiación electromagnética.

En espectrofotometría visible, la absorción o la transmisión de una determinada sustancia se puede determinar por el color observado. Por ejemplo, una muestra de solución que absorbe luz en todos los rangos visibles (es decir, no transmite ninguna de las longitudes de onda visibles) parece negra en teoría. Por otro lado, si se transmiten todas las longitudes de onda visibles (es decir, no absorbe nada), la muestra de solución aparece blanca. Si una muestra de solución absorbe luz roja (~700 nm), aparece verde porque el verde es el color complementario del rojo. Los espectrofotómetros visibles, en la práctica, usan un prisma para reducir un cierto rango de longitud de onda (para filtrar otras longitudes de onda) de modo que el haz de luz particular pase a través de una muestra de solución.

Dispositivos y mecanismo

La figura 1 ilustra la estructura básica de los espectrofotómetros. Consta de una fuente de luz, un colimador, un monocromador, un selector de longitud de onda, una cubeta para solución de muestra, un detector fotoeléctrico y una pantalla digital o un medidor. El mecanismo detallado se describe a continuación. La Figura 2 muestra un espectrofotómetro de muestra (Modelo: Spectronic 20D).

Un espectrofotómetro, en general, consta de dos dispositivos; un espectrómetro y un fotómetro. Un espectrómetro es un dispositivo que produce, normalmente dispersa y mide la luz. Un fotómetro indica el detector fotoeléctrico que mide la intensidad de la luz.

• Espectrómetro : produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero, un colimador (lente) transmite un haz directo de luz (fotones) que pasa a través de un monocromador (prisma) para dividirlo en varias longitudes de onda componentes (espectro). Luego, un selector de longitud de onda (rendija) transmite solo las longitudes de onda deseadas, como se muestra en la Figura 1.
• Fotómetro : después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a través de la solución de una muestra en cubeta, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que se absorbe y luego envía una señal a un galvanómetro o una pantalla digital, como se ilustra en la Figura 1.

Necesita un espectrómetro para producir una variedad de longitudes de onda porque diferentes compuestos absorben mejor en diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, el p-nitrofenol (forma ácida) tiene la absorbancia máxima a aproximadamente 320 nm y el p-nitrofenolato (forma básica) absorbe mejor a 400 nm, como se muestra en la Figura 3.

Mirando el gráfico que mide la absorbancia y la longitud de onda, también se puede observar un punto isosbéstico. Un punto isosbéstico es la longitud de onda en la que la absorbancia de dos o más especies es la misma. La aparición de un punto isosbéstico en una reacción demuestra que NO se requiere un intermedio para formar un producto a partir de un reactivo. La figura 4 muestra un ejemplo de un punto isosbéstico.

Volviendo a la Figura 1 (y la Figura 5), la cantidad de fotones que atraviesan la cubeta y llegan al detector depende de la longitud de la cubeta y de la concentración de la muestra. Una vez que conoce la intensidad de la luz después de que pasa a través de la cubeta, puede relacionarla con la transmitancia (T). La transmitancia es la fracción de luz que atraviesa la muestra. Esto se puede calcular usando la ecuación:

\(Transmitancia (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Donde I _t es la intensidad de la luz después de que el haz de luz pasa a través de la cubeta e I _o es la intensidad de la luz antes de que el haz de luz pase a través de la cubeta. La transmitancia está relacionada con la absorción por la expresión:

\(Absorbancia (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Donde la absorbancia representa la cantidad de fotones que se absorben. Con la cantidad de absorbancia conocida de la ecuación anterior, puede determinar la concentración desconocida de la muestra utilizando la Ley de Beer-Lambert. La Figura 5 ilustra la transmitancia de la luz a través de una muestra. La longitud \(l\) se utiliza para la Ley de Beer-Lambert que se describe a continuación.

Ley de Beer-Lambert

La Ley de Beer-Lambert (también conocida como Ley de Beer) establece que existe una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra. Por esta razón, la Ley de Beer solo se puede aplicar cuando existe una relación lineal. La ley de Beer se escribe como:

\(A = \epsilon{lc} \)

donde

• \(A\) es la medida de absorbancia (sin unidades),
• \(\epsilon\) es el coeficiente de extinción molar o la absortividad molar (o coeficiente de absorción),
• \(l\) es la longitud del camino, y
• \(c\) es la concentración.

El coeficiente de extinción molar se da como una constante y varía para cada molécula. Dado que la absorbancia no tiene unidades, las unidades de \(\epsilon\) deben cancelar las unidades de longitud y concentración. Como resultado, \(\epsilon\) tiene las unidades: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . La longitud del camino se mide en centímetros. Debido a que un espectrómetro estándar usa una cubeta de 1 cm de ancho, siempre se supone que \(l\) es igual a 1 cm. Dado que se conocen la absorción, \(\epsilon\) y la longitud del camino, podemos calcular la concentración \(c\) de la muestra.

Ejemplo 1

La guanosina tiene una absorbancia máxima de 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) y la longitud del camino es de 1 cm. Usando un espectrofotómetro, encuentras que \(A_{275} = 0,70\). ¿Cuál es la concentración de guanosina?

Solución

Para resolver este problema, debes usar la Ley de Beer.

\[A lc />

0.70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Luego, divida ambos lados entre [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8.33×10 ^-5 mol/L

Ejemplo 2

Hay una sustancia en una solución (4 g/litro). La longitud de la cubeta es de 2 cm y solo se transmite el 50% del haz de luz determinado. ¿Qué es el coeficiente de absorción?

Solución

Usando la Ley de Beer-Lambert, podemos calcular el coeficiente de absorción. Por lo tanto,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \épsilon\)

Entonces obtenemos que

\(\épsilon\) = 0.0376

Ejemplo 3

En el ejemplo 2 anterior, ¿cuánto es el haz de luz que se transmite cuando 8 g/litro?

Solución

Como conocemos \(\epsilon\), podemos calcular la transmisión usando la Ley de Beer-Lambert. Por lo tanto,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0.6016

Por lo tanto, \(I_t\) = 0.2503 = 25%

Ejemplo 4

En el ejemplo 2 anterior, ¿cuál es el coeficiente de absorción molar si el peso molecular es 100?

Solución

Se puede obtener simplemente multiplicando el coeficiente de absorción por el peso molecular. Por lo tanto,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Ejemplo 5

El coeficiente de absorción de un complejo de glucógeno-yodo es de 0,20 a una luz de 450 nm. ¿Cuál es la concentración cuando la transmisión es del 40 % en una cubeta de 2 cm?

Solución

También se puede resolver usando la Ley de Beer-Lambert. Por lo tanto,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Entonces \(c\) = 0.9948

Referencias

1. Atkins, Peter y Julio de Paula. Química Física para las Ciencias de la Vida. Nueva York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Química Física para las Biociencias. EE. UU.: University Science Books, 2005.
3. Gor, Michael. Espectrofotometría y Espectrofluorimetría. Nueva York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas y Dwek, Raymond y Wormald, Mark. Principios y Problemas de Química Física para Bioquímicos. RG Ratcliffe. Nueva York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Cálculos bioquímicos (Cómo resolver problemas matemáticos en bioquímica general), 2.ª edición, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Contribuidores y Atribuciones

• Kevin Vo (UCD)

Fuente