A espectrofotometria é um método para medir a quantidade de substância química que absorve a luz medindo a intensidade da luz à medida que um feixe de luz passa através da solução de amostra. O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz sobre uma certa gama de comprimentos de onda. Esta medição também pode ser utilizada para medir a quantidade de uma substância química conhecida. A espectrofotometria é um dos métodos mais úteis de análise quantitativa em vários domínios como química, física, bioquímica, engenharia material e química e aplicações clínicas.

Introdução

Cada composto químico absorve, transmite ou reflete a luz (radiação eletromagnética) sobre uma certa gama de comprimentos de onda. A espectrofotometria é uma medição da quantidade de uma substância química que absorve ou transmite. A espectrofometria é amplamente utilizada para análise quantitativa em várias áreas (por exemplo, química, física, biologia, bioquímica, engenharia material e química, aplicações clínicas, aplicações industriais, etc). Qualquer aplicação que lide com substâncias ou materiais químicos pode usar esta técnica. Na bioquímica, por exemplo, é usada para determinar reações enzimáticas catalisadas. Em aplicações clínicas, é usado para examinar sangue ou tecidos para o diagnóstico clínico. Existem também várias variações da espectrofotometria, tais como espectrofotometria de absorção atómica e espectrofotometria de emissão atómica.

Um espectrofotómetro é um instrumento que mede a quantidade de fotões (a intensidade da luz) absorvida após a sua passagem através da solução de amostra. Com o espectrofotómetro, a quantidade de uma substância química conhecida (concentrações) também pode ser determinada medindo a intensidade da luz detetada. Dependendo da gama de comprimento de onda da fonte luminosa, pode ser classificado em dois tipos diferentes:

• Espectrofotómetro visível uv: utiliza luz sobre a gama ultravioleta (185 – 400 nm) e alcance visível (400 – 700 nm) do espectro de radiação eletromagnética.
• Espectrofotómetro iv: utiliza luz sobre a gama de infravermelhos (700 – 15000 nm) do espectro de radiação eletromagnética.

Na espectrofotometria visível, a absorção ou a transmissão de uma determinada substância podem ser determinadas pela cor observada. Por exemplo, uma amostra de solução que absorve a luz sobre todas as gamas visíveis (ou seja, não transmite nenhum dos comprimentos de onda visíveis) parece preta em teoria. Por outro lado, se todos os comprimentos de onda visíveis forem transmitidos (isto é, não absorve nada), a amostra de solução aparece branca. Se uma amostra de solução absorver a luz vermelha (~700 nm), parece verde porque o verde é a cor complementar do vermelho. Os espectrofotómetros visíveis, na prática, utilizam um prisma para reduzir uma certa gama de comprimentos de onda (para filtrar outros comprimentos de onda) de modo a que o feixe de luz específico seja passado através de uma amostra de solução.

Dispositivos e mecanismos

A figura 1 ilustra a estrutura básica dos espectrofotómetros. É constituída por uma fonte de luz, um collimator, um monocromático, um seletor de comprimento de onda, uma cuvette para a solução de amostra, um detetor fotoelétrico, e um ecrã digital ou um medidor. O mecanismo detalhado é descrito abaixo. A figura 2 mostra um espectrofotómetro de amostra (Modelo: Espectro: Spectronic 20D).

Um espectrofotómetro, em geral, é composto por dois dispositivos; um espectrómetro e um fotometro. Um espectrómetro é um dispositivo que produz, normalmente dispersa e mede a luz. Um fotometro indica o detetor fotoelétrico que mede a intensidade da luz.

• Espectrómetro: Produz uma gama desejada de comprimento de onda de luz. Primeiro, um colecionador (lente) transmite um feixe reto de luz (fotões) que passa através de um monocromador (prisma) para dividi-lo em vários comprimentos de onda componentes (espectro). Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) transmite apenas os comprimentos de onda desejados, como mostra a Figura 1.
• Fotometro: Após a gama desejada de comprimento de onda de luz passar através da solução de uma amostra em cuvette, o fototâmetro deteta a quantidade de fotões que é absorvido e, em seguida, envia um sinal para um galvanómetro ou um ecrã digital, como ilustrado na Figura 1.

Você precisa de um espectrómetro para produzir uma variedade de comprimentos de onda porque diferentes compostos absorvem melhor em diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, o p-nitrofenol (forma ácida) tem a absorvância máxima a aproximadamente 320 nm e o p-nitrofenolato (forma básica) absorvem melhor a 400nm, como mostra a Figura 3.

Olhando para o gráfico que mede a absorvância e o comprimento de onda, também pode observar-se um ponto isoóstico. Um ponto isossbestico é o comprimento de onda em que a absorvância de duas ou mais espécies são as mesmas. O aparecimento de um ponto isosbestico numa reação demonstra que um intermediário NÃO é necessário para formar um produto a partir de um reativo. A figura 4 mostra um exemplo de um ponto isossbestico.

Referindo-se à Figura 1 (e figura 5), a quantidade de fotões que passa pela cuvette e pelo detetor depende do comprimento da cuvette e da concentração da amostra. Uma vez que você sabe a intensidade da luz depois de passar através da cuvette, você pode relacioná-lo com a transmissão (T). A transmissão é a fração de luz que passa através da amostra. Isto pode ser calculado usando a equação:

\(Transmissão (T) = \dfrac{I_t}{I_o}\)

Onde _It é a intensidade da luz após o feixe de luz passar através da cuvette e _Io é a intensidade da luz antes que o feixe de luz passe através da cuvette. A transmissão está relacionada com a absorção pela expressão:

\(Absorvância (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o})\)

Onde a absorvância representa a quantidade de fotões que é absorvida. Com a quantidade de absorvância conhecida da equação acima, pode determinar a concentração desconhecida da amostra usando a Lei Beer-Lambert. A figura 5 ilustra a transmissão da luz através de uma amostra. O comprimento \(l\) é utilizado para a Lei Beer-Lambert descrita abaixo.

Lei Beer-Lambert

A Lei Beer-Lambert (também conhecida como Lei da Cerveja) estabelece que existe uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma amostra. Por esta razão, a Lei da Cerveja só pode ser aplicada quando há uma relação linear. A Lei da Cerveja está escrita como:

\(A = \epsilon{lc}\)

onde

• \(A\) é a medida de absorvância (sem unidades),
• \(\epsilon\) é o coeficiente de extinção molar ou absortividade molar (ou coeficiente de absorção),
• \(l\) é o comprimento do caminho, e
• \(c\) é a concentração.

O coeficiente de extinção molar é dado como uma constante e varia para cada molécula. Uma vez que a absorvância não transporta nenhuma unidade, as unidades para \(\epsilon\) devem cancelar as unidades de comprimento e concentração. Como resultado, \(\epsilon\) tem as unidades: L·^mol-1·^cm-1. O comprimento do caminho é medido em centímetros. Como um espectrómetro padrão utiliza uma cuvette de 1 cm de largura, assume-se sempre que é igual a 1 cm. Uma vez que a absorção, \(\epsilon\), e o comprimento do caminho são conhecidos, podemos calcular a concentração \(c\) da amostra.

Exemplo 1

Guanosine tem uma absorvância máxima de 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1}\) e o comprimento do caminho é de 1 cm. Utilizando um espectrofotómetro, encontra-se o “A_{275}= 0,70\). Qual é a concentração de guanosina?

Solução

Para resolver este problema, tem de usar a Lei da Cerveja.

\[A lc />

0,70 = (8400 ^M-1cm-1)(1 cm)((c\))

Em seguida, divida ambos os lados por [8400 ^M-1cm-1)(1 cm)]

\(c\) = 8.33×10-5 ^mol/L

Exemplo 2

Há uma substância numa solução (4 g/litro). O comprimento da cuvette é de 2 cm e apenas 50% do feixe de luz é transmitido. Qual é o coeficiente de absorção?

Solução

Usando a Lei Beer-Lambert, podemos calcular o coeficiente de absorção. Assim,

\\\log \left\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log (\dfrac{0.5}{1.0}) = A = {8} \epsilon\)

Então obtemos que

\(\epsilon\) = 0,0376

Exemplo 3

No exemplo 2 acima, quanto é que o feixe de luz é transmitido quando 8 g/litro ?

Solução

Uma vez que sabemos \(\epsilon\), podemos calcular a transmissão usando a Lei Beer-Lambert. Assim,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log (I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\\log(I_t)\) = -0,6016

Portanto, \(I_t\) = 0,2503 = 25%

Exemplo 4

Por exemplo, 2 acima, o que é o coeficiente de absorção molar se o peso molecular for de 100?

Solução

Pode simplesmente obter multiplicando o coeficiente de absorção pelo peso molecular. Assim,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·^mol-1·cm-1

Exemplo 5

O coeficiente de absorção de um complexo de glicogénio-iodo é de 0,20 à luz de 450 nm. Qual é a concentração quando a transmissão é de 40 % numa cuvette de 2 cm?

Solução

Também pode ser resolvido usando a Lei Beer-Lambert. Portanto,

\\\ \log(I_t) = – \log (0.4) = 0,20 \vezes c \vezes 2\]

Então \(c\) = 0,9948

Referências

1. Atkins, Pedro e Júlio de Paula. Química Física para as Ciências da Vida. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Química Física para as Biociências. EUA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Espectrofotometria & Espectrofluormetria. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas e Dwek, Raymond e Wormald, Mark. Princípios e Problemas em Química Física para Bioquímicos. R. G. Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Cálculos Bioquímicos (Como Resolver Problemas Matemáticos em Bioquímica Geral), 2ª edição, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Contribuintes e Atribuições

• Kevin Vo (UCD)

Fonte