Spektrofotometria on menetelmä, jolla mitataan, kuinka paljon kemiallinen aine absorboi valoa mittaamalla valon intensiteetti, kun valonsäde kulkee näyteliuoksen läpi. Perusperiaate on, että jokainen yhdiste absorboi tai lähettää valoa tietyllä aallonpituusalueella. Tätä mittausta voidaan käyttää myös tunnetun kemiallisen aineen määrän mittaamiseen. Spektrofotometria on yksi hyödyllisimmistä kvantitatiivisen analyysin menetelmistä eri aloilla, kuten kemiassa, fysiikassa, biokemiassa, materiaali- ja kemiantekniikassa sekä kliinisissä sovelluksissa.

Johdanto

Jokainen kemiallinen yhdiste absorboi, lähettää tai heijastaa valoa (sähkömagneettista säteilyä) tietyllä aallonpituusalueella. Spektrofotometria mittaa, kuinka paljon kemiallinen aine absorboi tai läpäisee. Spektrofotometriaa käytetään laajasti kvantitatiiviseen analyyseihin eri aloilla (esim. kemia, fysiikka, biologia, biokemia, materiaali- ja kemiantekniikka, kliiniset sovellukset, teolliset sovellukset jne.). Kaikki kemiallisia aineita tai materiaaleja käsittelevät sovellukset voivat käyttää tätä tekniikkaa. Esimerkiksi biokemiassa sitä käytetään määrittämään entsyymikatalysoimia reaktioita. Kliinisissä sovelluksissa sitä käytetään veren tai kudosten tutkimiseen kliinistä diagnoosia varten. Spektrofotometriasta on myös useita muunnelmia, kuten atomiabsorptiospektrofotometria ja atomiemissiospektrofotometria.

Spektrofotometri on laite, joka mittaa absorboituneiden fotonien määrää (valon intensiteettiä), kun se on kulkenut näyteliuoksen läpi. Spektrofotometrillä voidaan määrittää myös tunnetun kemiallisen aineen määrä (pitoisuudet) mittaamalla havaitun valon intensiteetti. Valonlähteen aallonpituusalueesta riippuen se voidaan luokitella kahteen eri tyyppiin:

• UV-näkyvä spektrofotometri : käyttää valoa sähkömagneettisen säteilyn spektrin ultraviolettialueella (185-400 nm) ja näkyvällä alueella (400-700 nm).
• IR-spektrofotometri : käyttää valoa sähkömagneettisen säteilyn spektrin infrapuna-alueella (700 – 15000 nm).

Näkyvässä spektrofotometriassa tietyn aineen absorptio tai läpäisy voidaan määrittää havaitun värin perusteella. Esimerkiksi liuosnäyte, joka absorboi valoa kaikilla näkyvillä alueilla (eli ei lähetä mitään näkyvää aallonpituutta), näyttää teoriassa mustalta. Toisaalta, jos kaikki näkyvät aallonpituudet lähetetään (eli ei absorboi mitään), liuosnäyte näyttää valkoiselta. Jos liuosnäyte absorboi punaista valoa (~700 nm), se näyttää vihreältä, koska vihreä on punaisen täydentävä väri. Näkyvät spektrofotometrit käyttävät käytännössä prismaa kaventaakseen tiettyä aallonpituusaluetta (suodattaakseen pois muut aallonpituudet) niin, että tietty valonsäde kulkee liuosnäytteen läpi.

Laitteet ja mekanismit

Kuvassa 1 on esitetty spektrofotometrien perusrakenne. Se koostuu valonlähteestä, kollimaattorista, monokromaattorista, aallonpituuden valitsimesta, kyvetistä näyteliuosta varten, valosähköisestä tunnistimesta ja digitaalisesta näytöstä tai mittarista. Yksityiskohtainen mekanismi on kuvattu alla. Kuvassa 2 on näytespektrofotometri (malli: Spectronic 20D).

Spektrofotometri koostuu yleensä kahdesta laitteesta; spektrometri ja fotometri. Spektrometri on laite, joka tuottaa, tyypillisesti hajottaa ja mittaa valoa. Fotometri osoittaa valosähköisen ilmaisimen, joka mittaa valon voimakkuutta.

• Spektrometri : Se tuottaa halutun valon aallonpituusalueen. Ensin kollimaattori (linssi) lähettää suoran valonsäteen (fotoneja), joka kulkee monokromaattorin (prisman) läpi jakaakseen sen useisiin komponenttiaallonpituuksiin (spektriin). Sitten aallonpituuden valitsin (rako) lähettää vain halutut aallonpituudet, kuten kuvassa 1 näkyy.
• Fotometri : Kun haluttu valon aallonpituusalue on kulkenut kyvetissä olevan näytteen liuoksen läpi, fotometri havaitsee absorboituneiden fotonien määrän ja lähettää sitten signaalin galvanometriin tai digitaaliseen näyttöön, kuten kuvassa 1.

Tarvitset spektrometrin tuottaaksesi erilaisia aallonpituuksia, koska eri yhdisteet absorboivat parhaiten eri aallonpituuksilla. Esimerkiksi p-nitrofenolin (happomuoto) suurin absorbanssi on noin 320 nm:ssä ja p-nitrofenolaatti (perusmuoto) absorboi parhaiten 400 nm:ssä, kuten kuvassa 3 näkyy.

Katsomalla kuvaajaa, joka mittaa absorbanssia ja aallonpituutta, voidaan havaita myös isosbestinen piste. Isobestinen piste on aallonpituus, jossa kahden tai useamman lajin absorbanssi on sama. Isobestisen pisteen esiintyminen reaktiossa osoittaa, että välituotetta EI vaadita tuotteen muodostamiseksi reaktantista. Kuvassa 4 on esimerkki isosbestipisteestä.

Viitaten takaisin kuvaan 1 (ja kuvioon 5), kyvetin läpi ja detektoriin menevien fotonien määrä riippuu kyvetin pituudesta ja näytteen pitoisuudesta. Kun tiedät valon voimakkuuden sen jälkeen, kun se kulkee kyvetin läpi, voit suhteuttaa sen läpäisyyn (T). Läpäisykyky on näytteen läpi kulkeva valon osuus. Tämä voidaan laskea kaavalla:

\(Lähettävyys (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Missä I _t on valon intensiteetti sen jälkeen, kun valonsäde kulkee kyvetin läpi, ja I _o on valon intensiteetti ennen kuin valonsäde kulkee kyvetin läpi. Transmissio liittyy absorptioon lausekkeella:

\(Absorbanssi (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Missä absorbanssi tarkoittaa absorboituneiden fotonien määrää. Yllä olevasta yhtälöstä tunnetulla absorbanssimäärällä voit määrittää näytteen tuntemattoman pitoisuuden Beer-Lambertin lain avulla. Kuva 5 esittää valon läpäisyä näytteen läpi. Pituutta \(l\) käytetään alla kuvaillulle Beer-Lambertin laille.

Beer-Lambertin laki

Beer-Lambertin laki (tunnetaan myös nimellä Beerin laki) sanoo, että näytteen absorbanssin ja pitoisuuden välillä on lineaarinen suhde. Tästä syystä Beerin lakia voidaan soveltaa vain , kun on olemassa lineaarinen suhde. Beer’s Law on kirjoitettu seuraavasti:

\(A = \epsilon{lc} \)

missä

• \(A\) on absorbanssin mitta (ei yksikköä),
• \(\epsilon\) on molaarinen ekstinktiokerroin tai molaarinen absorptio (tai absorptiokerroin),
• \(l\) on polun pituus ja
• \(c\) on pitoisuus.

Molaarinen ekstinktiokerroin annetaan vakiona ja vaihtelee kunkin molekyylin osalta. Koska absorbanssissa ei ole yksiköitä, \(\epsilon\):n yksiköiden on kumottava pituus- ja konsentraatioyksiköt. Tuloksena \(\epsilon\) on yksiköt: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Reitin pituus mitataan senttimetreinä. Koska tavallinen spektrometri käyttää kyvettiä, jonka leveys on 1 cm, \(l\) oletetaan aina yhtä suureksi kuin 1 cm. Koska absorptio, \(\epsilon\) ja polun pituus tunnetaan, voimme laskea näytteen pitoisuuden \(c\).

Esimerkki 1

Guanosiinin suurin absorbanssi on 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) ja polun pituus on 1 cm. Spektrofotometriä käyttämällä löydät \(A_{275} = 0,70\). Mikä on guanosiinin pitoisuus?

Ratkaisu

Tämän ongelman ratkaisemiseksi sinun on käytettävä Beerin lakia.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 ) (1 cm) (\(c\))

Jaa seuraavaksi molemmat puolet [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33 x ^10-5 mol/l

Esimerkki 2

Liuoksessa on ainetta (4 g/l). Kyvetin pituus on 2 cm ja vain 50 % tietystä valonsäteestä läpäisee. Mikä on absorptiokerroin?

Ratkaisu

Beer-Lambertin lain avulla voimme laskea absorptiokertoimen. Täten,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epsilon\)

Sitten saamme sen

\(\epsilon\) = 0,0376

Esimerkki 3

Yllä olevassa esimerkissä 2, kuinka paljon valonsäde läpäisee, kun 8 g/litra ?

Ratkaisu

Koska tiedämme \(\epsilon\), voimme laskea lähetyksen Beer-Lambertin lain avulla. Täten,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Siksi \(I_t\) = 0,2503 = 25 %

Esimerkki 4

Mikä on yllä olevassa esimerkissä 2 molaarinen absorptiokerroin, jos molekyylipaino on 100?

Ratkaisu

Se voidaan saada yksinkertaisesti kertomalla absorptiokerroin molekyylipainolla. Täten,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 · cm ^–1

Esimerkki 5

Glykogeeni-jodi-kompleksin absorptiokerroin on 0,20 450 nm:n valossa. Mikä on pitoisuus, kun läpäisy on 40 % 2 cm:n kyvetissä?

Ratkaisu

Se voidaan myös ratkaista Beer-Lambert-lain avulla. Siksi,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Sitten \(c\) = 0,9948

Viitteet

1. Atkins, Peter ja Julio de Paula. Fysikaalista kemiaa biotieteille. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Fysikaalista kemiaa biotieteille. USA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrofotometria ja spektrofluorimetria. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas ja Dwek, Raymond ja Wormald, Mark. Fysikaalisen kemian periaatteet ja ongelmat biokemisteille. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. painos, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Osallistujat ja tekijät

• Kevin Vo (UCD)

Lähde