Spektrofotometria to metoda pomiaru stopnia pochłaniania światła przez substancję chemiczną poprzez pomiar natężenia światła podczas przechodzenia wiązki światła przez roztwór próbki. Podstawową zasadą jest to, że każdy związek pochłania lub przepuszcza światło w określonym zakresie długości fal. Pomiar ten można również wykorzystać do pomiaru ilości znanej substancji chemicznej. Spektrofotometria jest jedną z najbardziej użytecznych metod analizy ilościowej w różnych dziedzinach, takich jak chemia, fizyka, biochemia, inżynieria materiałowa i chemiczna oraz zastosowania kliniczne.

Wstęp

Każdy związek chemiczny pochłania, przepuszcza lub odbija światło (promieniowanie elektromagnetyczne) w określonym zakresie długości fal. Spektrofotometria to pomiar tego, ile substancja chemiczna pochłania lub przenosi. Spektrofotometria jest szeroko stosowana do analizy ilościowej w różnych dziedzinach (np. chemia, fizyka, biologia, biochemia, inżynieria materiałowa i chemiczna, zastosowania kliniczne, zastosowania przemysłowe itp.). Każda aplikacja, która zajmuje się substancjami chemicznymi lub materiałami, może wykorzystywać tę technikę. Na przykład w biochemii służy do określania reakcji katalizowanych enzymami. W zastosowaniach klinicznych służy do badania krwi lub tkanek w celu diagnozy klinicznej. Istnieje również kilka odmian spektrofotometrii, takich jak spektrofotometria absorpcji atomowej i spektrofotometria emisji atomowej.

Spektrofotometr to przyrząd, który mierzy ilość fotonów (natężenie światła) pochłoniętego po przejściu przez roztwór próbki. Za pomocą spektrofotometru można również określić ilość znanej substancji chemicznej (stężenia) poprzez pomiar natężenia wykrytego światła. W zależności od zakresu długości fali źródła światła można je podzielić na dwa różne typy:

• Spektrofotometr UV-widzialny : wykorzystuje światło w zakresie ultrafioletowym (185 – 400 nm) i widzialnym (400 – 700 nm) widma promieniowania elektromagnetycznego.
• Spektrofotometr IR : wykorzystuje światło w zakresie podczerwieni (700 – 15000 nm) widma promieniowania elektromagnetycznego.

W spektrofotometrii widzialnej absorpcję lub transmisję danej substancji można określić na podstawie obserwowanej barwy. Na przykład próbka roztworu, która pochłania światło we wszystkich widzialnych zakresach (tj. nie przepuszcza żadnej widzialnej długości fali) teoretycznie wydaje się czarna. Z drugiej strony, jeśli wszystkie widzialne długości fal są transmitowane (tj. nic nie absorbują), próbka roztworu wydaje się biała. Jeśli próbka roztworu absorbuje światło czerwone (~700 nm), wydaje się zielone, ponieważ zielony jest kolorem dopełniającym czerwieni. W praktyce spektrofotometry widzialne wykorzystują pryzmat do zawężenia pewnego zakresu długości fali (w celu odfiltrowania innych długości fal), tak aby wiązka światła przechodziła przez próbkę roztworu.

Urządzenia i mechanizm

Rysunek 1 ilustruje podstawową strukturę spektrofotometrów. Składa się ze źródła światła, kolimatora, monochromatora, selektora długości fali, kuwety na roztwór próbki, detektora fotoelektrycznego oraz wyświetlacza cyfrowego lub miernika. Szczegółowy mechanizm opisano poniżej. Rysunek 2 przedstawia przykładowy spektrofotometr (model: Spectronic 20D).

Na ogół spektrofotometr składa się z dwóch urządzeń; spektrometr i fotometr. Spektrometr to urządzenie, które wytwarza, zazwyczaj rozprasza i mierzy światło. Fotometr wskazuje detektor fotoelektryczny, który mierzy natężenie światła.

• Spektrometr : wytwarza żądany zakres długości fali światła. Najpierw kolimator (soczewka) przesyła prostą wiązkę światła (fotony), która przechodzi przez monochromator (pryzmat), aby podzielić ją na kilka składowych długości fal (widmo). Następnie selektor długości fali (szczelina) przesyła tylko żądane długości fal, jak pokazano na rysunku 1.
• Fotometr : Po przejściu żądanego zakresu długości fali światła przez roztwór próbki w kuwecie fotometr wykrywa ilość fotonów, które są pochłaniane, a następnie wysyła sygnał do galwanometru lub wyświetlacza cyfrowego, jak pokazano na rysunku 1.

Potrzebujesz spektrometru, aby wytworzyć różne długości fal, ponieważ różne związki najlepiej absorbują przy różnych długościach fal. Na przykład p-nitrofenol (postać kwasowa) ma maksymalną absorbancję przy około 320 nm, a p-nitrofenolan (postać podstawowa) najlepiej absorbuje przy 400 nm, jak pokazano na rysunku 3.

Patrząc na wykres, który mierzy absorbancję i długość fali, można również zaobserwować punkt izobestyczny. Punkt izobestyczny to długość fali, przy której absorbancja dwóch lub więcej gatunków jest taka sama. Pojawienie się w reakcji punktu izobestycznego pokazuje, że półprodukt NIE jest wymagany do wytworzenia produktu z substratu. Rysunek 4 przedstawia przykład punktu izobestycznego.

Wracając do rysunku 1 (i rysunku 5), ilość fotonów przechodzących przez kuwetę do detektora zależy od długości kuwety i stężenia próbki. Znając natężenie światła po przejściu przez kuwetę, można odnieść je do transmitancji (T). Transmitancja to ułamek światła przechodzącego przez próbkę. Można to obliczyć za pomocą równania:

\(Transmitancja (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Gdzie I _t to natężenie światła po przejściu wiązki światła przez kuwetę, a I _o to natężenie światła przed przejściem wiązki światła przez kuwetę. Przepuszczalność związana jest z absorpcją wyrażeniem:

\(Absorbancja (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Gdzie absorbancja oznacza ilość pochłoniętych fotonów. Mając wielkość absorbancji znaną z powyższego równania, można wyznaczyć nieznane stężenie próbki za pomocą prawa Beera-Lamberta. Rysunek 5 ilustruje przepuszczanie światła przez próbkę. Długość \(l\) jest używana dla opisanego poniżej prawa Beera-Lamberta.

Prawo Beer-Lambert

Prawo Beera-Lamberta (znane również jako Prawo Beera) stwierdza, że istnieje liniowa zależność między absorbancją a stężeniem próbki. Z tego powodu prawo Beera może być stosowane tylko wtedy, gdy istnieje zależność liniowa. Prawo piwa jest zapisane jako:

\(A = \epsilon{lc} \)

gdzie

• \(A\) to miara absorbancji (bez jednostek),
• \(\epsilon\) to molowy współczynnik ekstynkcji lub molowa absorpcja (lub współczynnik absorpcji),
• \(l\) to długość ścieżki, a
• \(c\) to stężenie.

Molowy współczynnik ekstynkcji jest podawany jako stała i zmienia się dla każdej cząsteczki. Ponieważ absorbancja nie zawiera żadnych jednostek, jednostki \(\epsilon\) muszą skreślać jednostki długości i stężenia. W rezultacie \(\epsilon\) ma jednostki: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Długość ścieżki mierzona jest w centymetrach. Ponieważ standardowy spektrometr używa kuwety o szerokości 1 cm, przyjmuje się, że \(l\) jest równe 1 cm. Ponieważ absorpcja, \(\epsilon\) i długość drogi są znane, możemy obliczyć stężenie \(c\) próbki.

Przykład 1

Guanozyna ma maksymalną absorbancję 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) a długość ścieżki wynosi 1 cm. Używając spektrofotometru, można znaleźć \(A_{275} = 0,70\). Jakie jest stężenie guanozyny?

Rozwiązanie

Aby rozwiązać ten problem, musisz skorzystać z Prawa Beera.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Następnie podziel obie strony przez [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33×10 ^-5 mol/L

Przykład 2

W roztworze znajduje się substancja (4 g/litr). Długość kuwety wynosi 2 cm i przepuszczane jest tylko 50% określonej wiązki światła. Jaki jest współczynnik absorpcji?

Rozwiązanie

Korzystając z prawa Beera-Lamberta możemy obliczyć współczynnik absorpcji. Zatem,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epsilon\)

Wtedy uzyskujemy to

\(\epsilon\) = 0,0376

Przykład 3

W przykładzie 2 powyżej, ile światła jest transmitowane przy 8 g/litr?

Rozwiązanie

Ponieważ znamy \(\epsilon\), możemy obliczyć transmisję za pomocą prawa Beera-Lamberta. Zatem,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Dlatego \(I_t\) = 0,2503 = 25%

Przykład 4

W przykładzie 2 powyżej, jaki jest molowy współczynnik absorpcji, jeśli masa cząsteczkowa wynosi 100?

Rozwiązanie

Można to po prostu uzyskać, mnożąc współczynnik absorpcji przez masę cząsteczkową. Zatem,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Przykład 5

Współczynnik absorpcji kompleksu glikogen-jod wynosi 0,20 przy świetle 450 nm. Jakie jest stężenie, gdy transmisja wynosi 40% w kuwecie 2 cm?

Rozwiązanie

Można go również rozwiązać za pomocą prawa Beera-Lamberta. W związku z tym,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0,20 \times c \times 2\]

Wtedy \(c\) = 0,9948

Bibliografia

1. Atkinsa, Piotra i Julio de Paula. Chemia Fizyczna dla Nauk Przyrodniczych. Nowy Jork: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Rajmund. Chemia fizyczna dla nauk biologicznych. USA: Uniwersyteckie książki naukowe, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrofotometria i spektrofluorymetria. Nowy Jork: Oxford University Press, 2000.
4. Cena, Mikołaj i Dwek, Raymond i Wormald, Marek. Zasady i problemy w chemii fizycznej dla biochemików. RG Ratcliffe. Nowy Jork: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Obliczenia biochemiczne (Jak rozwiązywać problemy matematyczne w ogólnej biochemii), wydanie 2, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Współtwórcy i atrybucje

• Kevin Vo (UCD)

Źródło