Spectrofotometrie is een methode om te meten hoeveel een chemische stof licht absorbeert door de intensiteit van het licht te meten wanneer een lichtstraal door de monsteroplossing gaat. Het basisprincipe is dat elke verbinding licht absorbeert of doorlaat over een bepaald golflengtebereik. Deze meting kan ook worden gebruikt om de hoeveelheid van een bekende chemische stof te meten. Spectrofotometrie is een van de meest bruikbare methoden voor kwantitatieve analyse op verschillende gebieden, zoals chemie, natuurkunde, biochemie, materiaal- en chemische technologie en klinische toepassingen.

Invoering

Elke chemische verbinding absorbeert, zendt of reflecteert licht (elektromagnetische straling) over een bepaald golflengtebereik. Spectrofotometrie is een meting van hoeveel een chemische stof absorbeert of doorgeeft. Spectrofotometrie wordt veel gebruikt voor kwantitatieve analyse op verschillende gebieden (bijv. scheikunde, natuurkunde, biologie, biochemie, materiaal- en chemische technologie, klinische toepassingen, industriële toepassingen, enz.). Elke toepassing die zich bezighoudt met chemische stoffen of materialen kan deze techniek gebruiken. In de biochemie wordt het bijvoorbeeld gebruikt om door enzymen gekatalyseerde reacties te bepalen. In klinische toepassingen wordt het gebruikt om bloed of weefsels te onderzoeken voor klinische diagnose. Er zijn ook verschillende variaties van de spectrofotometrie, zoals atomaire absorptiespectrofotometrie en atomaire emissiespectrofotometrie.

Een spectrofotometer is een instrument dat de hoeveelheid fotonen (de lichtintensiteit) meet die wordt geabsorbeerd nadat het door de monsteroplossing is gegaan. Met de spectrofotometer kan ook de hoeveelheid van een bekende chemische stof (concentraties) worden bepaald door de intensiteit van het gedetecteerde licht te meten. Afhankelijk van het golflengtebereik van de lichtbron, kan deze in twee verschillende typen worden ingedeeld:

• UV-zichtbare spectrofotometer : gebruikt licht over het ultraviolette bereik (185 – 400 nm) en het zichtbare bereik (400 – 700 nm) van het elektromagnetische stralingsspectrum.
• IR-spectrofotometer : gebruikt licht over het infraroodbereik (700 – 15000 nm) van het elektromagnetische stralingsspectrum.

Bij zichtbare spectrofotometrie kan de absorptie of de transmissie van een bepaalde stof worden bepaald door de waargenomen kleur. Een voorbeeld van een oplossingsmonster dat licht absorbeert over alle zichtbare bereiken (dwz geen enkele zichtbare golflengte doorlaat) lijkt in theorie zwart. Aan de andere kant, als alle zichtbare golflengten worden doorgelaten (dwz niets absorbeert), ziet het oplossingsmonster er wit uit. Als een oplossingsmonster rood licht absorbeert (~ 700 nm), lijkt het groen omdat groen de complementaire kleur van rood is. Zichtbare spectrofotometers gebruiken in de praktijk een prisma om een bepaald golflengtebereik te verkleinen (om andere golflengten uit te filteren), zodat de specifieke lichtstraal door een oplossingsmonster wordt geleid.

Apparaten en mechanisme

Figuur 1 illustreert de basisstructuur van spectrofotometers. Het bestaat uit een lichtbron, een collimator, een monochromator, een golflengteselector, een cuvet voor monsteroplossing, een foto-elektrische detector en een digitaal display of een meter. Gedetailleerd mechanisme wordt hieronder beschreven. Figuur 2 toont een voorbeeldspectrofotometer (model: Spectronic 20D).

Een spectrofotometer bestaat over het algemeen uit twee apparaten; een spectrometer en een fotometer. Een spectrometer is een apparaat dat licht produceert, meestal verspreidt en meet. Een fotometer geeft de foto-elektrische detector aan die de intensiteit van het licht meet.

• Spectrometer : het produceert een gewenst golflengtebereik van licht. Eerst zendt een collimator (lens) een rechte lichtstraal (fotonen) uit die door een monochromator (prisma) gaat om deze te splitsen in verschillende componentgolflengten (spectrum). Vervolgens zendt een golflengteselector (spleet) alleen de gewenste golflengten uit, zoals weergegeven in figuur 1.
• Fotometer : nadat het gewenste golflengtebereik van het licht door de oplossing van een monster in de cuvet is gegaan, detecteert de fotometer de hoeveelheid fotonen die wordt geabsorbeerd en stuurt vervolgens een signaal naar een galvanometer of een digitaal display, zoals geïllustreerd in figuur 1.

Je hebt een spectrometer nodig om verschillende golflengten te produceren, omdat verschillende verbindingen het beste absorberen bij verschillende golflengten. Bijvoorbeeld, p-nitrofenol (zure vorm) heeft de maximale absorptie bij ongeveer 320 nm en p-nitrofenolaat (basisvorm) absorbeert het best bij 400 nm, zoals weergegeven in figuur 3.

Kijkend naar de grafiek die absorptie en golflengte meet, kan ook een isosbestisch punt worden waargenomen. Een isosbestisch punt is de golflengte waarin de absorptie van twee of meer soorten hetzelfde is. Het verschijnen van een isosbestisch punt in een reactie toont aan dat een tussenproduct NIET nodig is om een product uit een reactant te vormen. Figuur 4 toont een voorbeeld van een isosbestisch punt.

Terugverwijzend naar figuur 1 (en figuur 5), is de hoeveelheid fotonen die door de cuvet en in de detector gaat, afhankelijk van de lengte van de cuvet en de concentratie van het monster. Zodra u de intensiteit van het licht kent nadat het door de cuvet is gegaan, kunt u dit relateren aan transmissie (T). Doorlaatbaarheid is de fractie van het licht dat door het monster gaat. Dit kan worden berekend met behulp van de vergelijking:

\(Doorlaatbaarheid (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Waar I _t de lichtintensiteit is nadat de lichtstraal door de cuvet is gegaan en I _o de lichtintensiteit is voordat de lichtstraal door de cuvette is gegaan. Doorlaatbaarheid is gerelateerd aan absorptie door de uitdrukking:

\(Absorbantie (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Waarbij absorptie staat voor de hoeveelheid fotonen die wordt geabsorbeerd. Met de hoeveelheid absorptie die bekend is uit de bovenstaande vergelijking, kunt u de onbekende concentratie van het monster bepalen met behulp van de wet van Beer-Lambert. Figuur 5 illustreert de transmissie van licht door een monster. De lengte \(l\) wordt gebruikt voor de hieronder beschreven wet van Beer-Lambert.

Wet Beer-Lambert

De wet van Beer-Lambert (ook bekend als de wet van Beer) stelt dat er een lineair verband bestaat tussen de absorptie en de concentratie van een monster. Om deze reden kan de wet van Beer alleen worden toegepast als er een lineair verband is. De wet van Beer wordt geschreven als:

\(A = \epsilon{lc} \)

waar

• \(A\) is de maat voor absorptie (geen eenheden),
• \(\epsilon\) is de molaire extinctiecoëfficiënt of molaire absorptie (of absorptiecoëfficiënt),
• \(l\) is de padlengte, en
• \(c\) is de concentratie.

De molaire extinctiecoëfficiënt wordt gegeven als een constante en varieert voor elk molecuul. Aangezien absorptie geen eenheden bevat, moeten de eenheden voor \(\epsilon\) de eenheden van lengte en concentratie opheffen. Als resultaat heeft \(\epsilon\) de eenheden: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . De padlengte wordt gemeten in centimeters. Omdat een standaard spectrometer een cuvet gebruikt die 1 cm breed is, wordt altijd aangenomen dat \(l\) gelijk is aan 1 cm. Aangezien absorptie, \(\epsilon\), en padlengte bekend zijn, kunnen we de concentratie \(c\) van het monster berekenen.

voorbeeld 1

Guanosine heeft een maximale absorptie van 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) en de padlengte is 1 cm. Met behulp van een spectrofotometer vind je het dat \(A_{275} = 0,70\). Wat is de concentratie van guanosine?

Oplossing

Om dit probleem op te lossen, moet u de wet van Beer gebruiken.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Deel vervolgens beide zijden door [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33×10 ^-5 mol/L

Voorbeeld 2

Er zit een stof in een oplossing (4 g/liter). De lengte van de cuvette is 2 cm en slechts 50% van de bepaalde lichtstraal wordt doorgelaten. Wat is de absorptiecoëfficiënt?

Oplossing

Met behulp van de wet van Beer-Lambert kunnen we de absorptiecoëfficiënt berekenen. Dus,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epsilon\)

Dan krijgen we dat

\(\epsilon\) = 0,0376

Voorbeeld 3

Hoeveel wordt in voorbeeld 2 hierboven de lichtstraal doorgelaten bij 8 g/liter?

Oplossing

Aangezien we \(\epsilon\ kennen), kunnen we de transmissie berekenen met de wet van Beer-Lambert. Dus,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Daarom \(I_t\) = 0.2503 = 25%

Voorbeeld 4

Wat is in voorbeeld 2 hierboven de molaire absorptiecoëfficiënt als het molecuulgewicht 100 is?

Oplossing

Het kan eenvoudig worden verkregen door de absorptiecoëfficiënt te vermenigvuldigen met het molecuulgewicht. Dus,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Voorbeeld 5

De absorptiecoëfficiënt van een glycogeen-jodiumcomplex is 0,20 bij licht van 450 nm. Wat is de concentratie bij een transmissie van 40% in een cuvet van 2 cm?

Oplossing

Het kan ook worden opgelost met behulp van de wet van Beer-Lambert. Daarom,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Dan \(c\) = 0,9948

Referenties

1. Atkins, Peter en Julio de Paula. Fysische chemie voor de Life Sciences. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Fysische chemie voor de biowetenschappen. VS: University Science Books, 2005.
3. Goor, Michaël. Spectrofotometrie en spectrofluorimetrie. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas en Dwek, Raymond en Wormald, Mark. Principes en problemen in de fysische chemie voor biochemici. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (Hoe wiskundige problemen op te lossen in de algemene biochemie), 2e editie, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Bijdragers en toeschrijvingen

• Kevin Vo (UCD)

Bron