A spektrofotometria egy módszer annak mérésére, hogy egy kémiai anyag mennyire nyeli el a fényt a fény intenzitásának mérésével, amikor a fénysugár áthalad a mintaoldaton. Az alapelv az, hogy minden vegyület egy bizonyos hullámhossz-tartományban nyeli el vagy engedi át a fényt. Ez a mérés egy ismert kémiai anyag mennyiségének mérésére is használható. A spektrofotometria az egyik leghasznosabb kvantitatív elemzési módszer különféle területeken, mint például a kémia, fizika, biokémia, anyag- és vegyészmérnöki és klinikai alkalmazásokban.

Bevezetés

Minden kémiai vegyület elnyeli, továbbítja vagy visszaveri a fényt (elektromágneses sugárzást) egy bizonyos hullámhossz-tartományban. A spektrofotometria annak mérése, hogy egy kémiai anyag mennyit abszorbeál vagy enged át. A spektrofotometriát széles körben használják kvantitatív elemzésre különböző területeken (pl. kémia, fizika, biológia, biokémia, anyag- és vegyészmérnöki, klinikai alkalmazások, ipari alkalmazások stb.). Bármely alkalmazás, amely vegyi anyagokkal vagy anyagokkal foglalkozik, használhatja ezt a technikát. A biokémiában például enzimkatalizált reakciók meghatározására használják. Klinikai alkalmazásokban vér vagy szövetek vizsgálatára használják klinikai diagnózis céljából. A spektrofotometriának számos változata is létezik, mint például az atomabszorpciós spektrofotometria és az atomemissziós spektrofotometria.

A spektrofotométer egy olyan műszer, amely méri az elnyelt fotonok mennyiségét (a fény intenzitását), miután áthaladt a mintaoldaton. A spektrofotométerrel egy ismert kémiai anyag mennyisége (koncentrációi) is meghatározható a detektált fény intenzitásának mérésével. A fényforrás hullámhossz-tartományától függően két különböző típusra osztható:

• UV-látható spektrofotométer : az elektromágneses sugárzási spektrum ultraibolya tartományában (185-400 nm) és látható tartományában (400-700 nm) fényt használ.
• IR spektrofotométer : az elektromágneses sugárzási spektrum infravörös tartományában (700-15000 nm) fényt használ.

A látható spektrofotometriában egy bizonyos anyag abszorpciója vagy áteresztése a megfigyelt szín alapján határozható meg. Például egy oldatminta, amely minden látható tartományban elnyeli a fényt (azaz egyik látható hullámhosszon sem ereszt át), elméletileg feketének tűnik. Másrészt, ha az összes látható hullámhossz átkerül (azaz semmit sem nyel el), az oldatminta fehérnek tűnik. Ha egy oldatminta elnyeli a vörös fényt (~700 nm), akkor zöldnek tűnik, mert a zöld a vörös kiegészítő színe. A látható spektrofotométerek a gyakorlatban egy prizmát használnak a hullámhossz egy bizonyos tartományának leszűkítésére (más hullámhosszok kiszűrésére), így az adott fénysugár áthalad egy oldatmintán.

Eszközök és mechanizmusok

Az 1. ábra szemlélteti a spektrofotométerek alapvető felépítését. Fényforrásból, kollimátorból, monokromátorból, hullámhossz-választóból, mintaoldat-küvettából, fotoelektromos detektorból és digitális kijelzőből vagy mérőből áll. A részletes mechanizmus leírása alább található. A 2. ábra egy minta spektrofotométert mutat (Model: Spectronic 20D).

A spektrofotométer általában két eszközből áll; egy spektrométer és egy fotométer. A spektrométer olyan eszköz, amely fényt állít elő, jellemzően szétoszlat és mér. A fotométer jelzi a fotoelektromos detektort, amely a fény intenzitását méri.

• Spektrométer : A fény kívánt hullámhossz-tartományát állítja elő. Először egy kollimátor (lencse) egy egyenes fénysugarat (fotonokat) bocsát át, amely egy monokromátoron (prizmán) halad át, és azt több hullámhosszra (spektrumra) osztja fel. Ezután egy hullámhossz-választó (rés) csak a kívánt hullámhosszokat továbbítja, amint az 1. ábrán látható.
• Fotométer : Miután a fény kívánt hullámhossz-tartománya áthalad a minta küvettában lévő oldatán, a fotométer érzékeli az elnyelt fotonok mennyiségét, majd jelet küld egy galvanométerre vagy egy digitális kijelzőre, amint az 1. ábrán látható.

Különféle hullámhosszok előállításához spektrométerre van szükség, mert a különböző vegyületek különböző hullámhosszokon abszorbeálnak a legjobban. Például a p-nitro-fenol (savas forma) maximális abszorbanciája körülbelül 320 nm-en, a p-nitro-fenolát (bázisforma) pedig 400 nm-en abszorbeál legjobban, amint az a 3. ábrán látható.

Az abszorbanciát és a hullámhosszt mérő grafikont nézve egy izobesztikus pont is megfigyelhető. Az izobeszt pont az a hullámhossz, amelyen két vagy több faj abszorbanciája azonos. Az izobeszt pont megjelenése a reakcióban azt mutatja, hogy a reagensből termék előállításához NEM szükséges intermedier. A 4. ábra izobesztikus pontra mutat példát.

Visszatérve az 1. ábrára (és az 5. ábrára), a küvettán átmenő fotonok mennyisége a detektorba a küvetta hosszától és a minta koncentrációjától függ. Ha ismeri a fény intenzitását, miután áthaladt a küvettán, összefüggésbe hozhatja az áteresztőképességgel (T). Az áteresztőképesség a fény azon része, amely áthalad a mintán. Ezt a következő egyenlettel lehet kiszámítani:

\(Transzmittancia (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Ahol I _t a fény intenzitása, miután a fénysugár áthalad a küvettán, és I _o a fény intenzitása, mielőtt a fénysugár áthaladna a küvettán. Az áteresztőképesség az abszorpcióhoz kapcsolódik a következő kifejezéssel:

\(Abszorbancia (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Ahol az abszorbancia az elnyelt fotonok mennyiségét jelenti. A fenti egyenletből ismert abszorbancia mértékével meghatározhatja a minta ismeretlen koncentrációját a Beer-Lambert törvény segítségével. Az 5. ábra a fény áteresztőképességét szemlélteti egy mintán. A \(l\) hosszúságot az alábbiakban ismertetett Beer-Lambert törvényhez használjuk.

Beer-Lambert törvény

A Beer-Lambert törvény (más néven Beer törvénye) kimondja, hogy lineáris kapcsolat van a minta abszorbanciája és koncentrációja között. Emiatt a Beer-törvény csak lineáris kapcsolat esetén alkalmazható. A sörtörvény így íródott:

\(A = \epszilon{lc} \)

ahol

• \(A\) az abszorbancia mértéke (nincs mértékegység),
• \(\epsilon\) a moláris extinkciós együttható vagy moláris abszorpció (vagy abszorpciós együttható),
• \(l\) az útvonal hossza, és
• \(c\) a koncentráció.

A moláris extinkciós együttható konstansként van megadva, és molekulánként változik. Mivel az abszorbancia nem hordoz egységeket, az \(\epsilon\) egységeinek ki kell zárniuk a hossz és a koncentráció mértékegységeit. Ennek eredményeként \(\epsilon\) egységei: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Az út hosszát centiméterben mérik. Mivel a szabványos spektrométer 1 cm széles küvettát használ, \(l\) mindig 1 cm-nek felel meg. Mivel az abszorpció, \(\epsilon\) és úthossz ismert, ki tudjuk számítani a minta \(c\) koncentrációját.

1. példa

A guanozin maximális abszorbanciája 275 nm. \(\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) és az út hossza 1 cm. Egy spektrofotométer segítségével azt találja, hogy \(A_{275} = 0,70\). Mi a guanozin koncentrációja?

Megoldás

A probléma megoldásához a Beer-törvényt kell használni.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 ) (1 cm) (\(c\))

Ezután ossza el mindkét oldalt [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = ^8,33×10-5 mol/L

2. példa

Az oldatban anyag van (4 g/liter). A küvetta hossza 2 cm, és az adott fénysugárnak csak az 50%-a jut át. Mi az abszorpciós együttható?

Megoldás

A Beer-Lambert törvény segítségével kiszámíthatjuk az abszorpciós együtthatót. Így,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \epszilon\)

Akkor ezt megkapjuk

\(\epszilon\) = 0,0376

3. példa

A fenti 2. példában mekkora a fénysugár, ha 8 g/liter?

Megoldás

Mivel ismerjük a \(\epsilon\), az átvitelt a Beer-Lambert törvény segítségével tudjuk kiszámítani. Így,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Ezért \(I_t\) = 0,2503 = 25%

4. példa

A fenti 2. példában mekkora a moláris abszorpciós együttható, ha a molekulatömeg 100?

Megoldás

Egyszerűen megkapható, ha az abszorpciós együtthatót megszorozzuk a molekulatömeggel. Így,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 · cm ^–1

5. példa

A glikogén-jód komplex abszorpciós együtthatója 0,20 450 nm-es fénynél. Mekkora a koncentráció, ha egy 2 cm-es küvettában 40%-os az áteresztőképesség?

Megoldás

Beer-Lambert törvény segítségével is megoldható. Ezért,

\[- \log(I_t) = – \log(0.4) = 0.20 \times c \times 2\]

Ekkor \(c\) = 0,9948

Hivatkozások

1. Atkins, Peter és Julio de Paula. Fizikai kémia az élettudományok számára. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Fizikai kémia a biotudományok számára. USA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrofotometria és spektrofluorimetria. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas és Dwek, Raymond és Wormald, Mark. A fizikai kémia alapelvei és problémái biokémikusok számára. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. kiadás, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Közreműködők és forrásmegjelölések

• Kevin Vo (UCD)

Forrás