Tips og tricks til fotometriske målinger
Det er nyttigt at have i tankerne ikke kun selve den fotometriske måleproces, men også dens opsætning, målemiljøet og det anvendte udstyr.
Billedkilde: marodon 333/shutterstock.com
Fotometri er en almindelig, let udført metode til bestemmelse af koncentrationer af stoffer i opløsning, og den er også i stand til at vurdere prøvens renhed. Men i tilfælde, hvor værdier ikke giver indlysende mening, eller hvis de varierer betydeligt, kan fejlfinding være kompleks. Det er derfor nyttigt at eliminere mulige fejlkilder fra starten og være særlig opmærksom på følgende overvejelser ved opsætning og udførelse af fotometriske målinger.
Opsætning & Miljø
Opløsningsmiddel
Absorbansen af en prøve er påvirket af dens pH og ionstyrken af dens opløsningsmiddel [1]. Buffere med et lavt saltindhold og en neutral eller let alkalisk pH, som forhindrer variationer i pH, anbefales. Samtidig bør bufferens iboende absorbans ved den bølgelængde, der måles, være lav for at undgå mulige begrænsninger af måleområdet.
Fortynding
I tilfælde af stærkt koncentrerede prøveopløsninger kan fortynding være nødvendig for at holde sig inden for det lineære måleområde. Fortyndinger i området 1:10 er ideelle. Fortyndinger højere end 1:50 anbefales ikke på grund af den stigende risiko for unøjagtigheder introduceret via dette pipeteringstrin. I princippet skal der anvendes et kalibreret system af pipette og pipettespidser til nøjagtig og præcis pipettering.
Blanding
Efter klargøring af fortyndinger, men også efter lange perioder med immobilitet, kan der opstå lokale koncentrationsforskelle i prøven. Det er derfor vigtigt at blande prøveopløsningen grundigt før og efter hvert fortyndingstrin, såvel som umiddelbart før måling. De bedste resultater opnås gennem vortexing.
Temperatur
Miljøet og fotometret samt kuvetter og prøver bør holdes ved identiske temperaturer for at forhindre en afdrift af de målte værdier.
Udstyr & Måling
Kuvetter
Ved valg af kuvetter er deres gennemsigtighed ved de nødvendige bølgelængder, samt deres kompatibilitet med det respektive fotometer, blandt de vigtigste afgørende faktorer. Dette omfatter f.eks. koordinering af højderne af lysvejene og sikring af, at kuvetterne fyldes med tilstrækkelige prøvevolumener. For at opnå nøjagtige resultater bør blindprøven såvel som prøverne måles i den samme kuvette, med kuvetten altid placeret i samme retning i kuvetteskaftet.
Måling
Inden måling skal man sørge for at undgå dannelse af luftbobler inde i kuvetten, som ville afbryde lysvejen (dette gælder både for blindprøven og prøverne). Fotometerindstillingerne skal passe til den valgte metode, prøven og de valgte kuvetter. Efter målingen skal alle resultater kontrolleres for plausibilitet.
Referencer:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Effekt af pH og ionstyrke på den spektrofotometriske vurdering af nukleinsyrerenhed. BioTechniques 1997; 22:474-481.