Spektrophotometrie ist eine Methode zur Messung, wie stark eine chemische Substanz Licht absorbiert, indem die Lichtintensität gemessen wird, wenn ein Lichtstrahl durch eine Probenlösung geht. Das Grundprinzip besteht darin, dass jede Verbindung Licht über einen bestimmten Wellenlängenbereich absorbiert oder durchlässt. Diese Messung kann auch verwendet werden, um die Menge einer bekannten chemischen Substanz zu messen. Die Spektrophotometrie ist eine der nützlichsten Methoden der quantitativen Analyse in verschiedenen Bereichen wie Chemie, Physik, Biochemie, Material- und Verfahrenstechnik und klinischen Anwendungen.

Einführung

Jede chemische Verbindung absorbiert, überträgt oder reflektiert Licht (elektromagnetische Strahlung) über einen bestimmten Wellenlängenbereich. Spektrophotometrie ist ein Maß dafür, wie viel eine chemische Substanz absorbiert oder durchlässt. Die Spektrophotometrie wird weit verbreitet für die quantitative Analyse in verschiedenen Bereichen (z. B. Chemie, Physik, Biologie, Biochemie, Material- und Verfahrenstechnik, klinische Anwendungen, industrielle Anwendungen usw.) verwendet. Jede Anwendung, die mit chemischen Substanzen oder Materialien zu tun hat, kann diese Technik verwenden. In der Biochemie wird es beispielsweise zur Bestimmung enzymkatalysierter Reaktionen eingesetzt. In klinischen Anwendungen wird es verwendet, um Blut oder Gewebe für die klinische Diagnose zu untersuchen. Es gibt auch mehrere Variationen der Spektrophotometrie, wie die Atomabsorptionsspektrophotometrie und die Atomemissionsspektrophotometrie.

Ein Spektrophotometer ist ein Instrument, das die Menge an Photonen (die Intensität des Lichts) misst, die absorbiert werden, nachdem es die Probenlösung passiert hat. Mit dem Spektralphotometer kann die Menge einer bekannten chemischen Substanz (Konzentration) auch durch Messung der detektierten Lichtintensität bestimmt werden. Abhängig vom Wellenlängenbereich der Lichtquelle kann sie in zwei verschiedene Typen eingeteilt werden:

• UV-Vis-Spektrophotometer : verwendet Licht über den ultravioletten Bereich (185–400 nm) und den sichtbaren Bereich (400–700 nm) des elektromagnetischen Strahlungsspektrums.
• IR-Spektrophotometer : verwendet Licht im Infrarotbereich (700–15000 nm) des elektromagnetischen Strahlungsspektrums.

Bei der sichtbaren Spektrophotometrie kann die Absorption oder die Transmission einer bestimmten Substanz anhand der beobachteten Farbe bestimmt werden. Zum Beispiel erscheint eine Lösungsprobe, die Licht über alle sichtbaren Bereiche absorbiert (dh keine sichtbaren Wellenlängen durchlässt), theoretisch schwarz. Wenn andererseits alle sichtbaren Wellenlängen durchgelassen werden (dh nichts absorbiert wird), erscheint die Lösungsprobe weiß. Wenn eine Lösungsprobe rotes Licht (~700 nm) absorbiert, erscheint sie grün, da Grün die Komplementärfarbe von Rot ist. Sichtbare Spektralphotometer verwenden in der Praxis ein Prisma, um einen bestimmten Wellenlängenbereich einzugrenzen (um andere Wellenlängen herauszufiltern), so dass der bestimmte Lichtstrahl durch eine Lösungsprobe geleitet wird.

Geräte und Mechanismus

Abbildung 1 veranschaulicht den grundlegenden Aufbau von Spektralfotometern. Es besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator, einem Monochromator, einem Wellenlängenwähler, einer Küvette für die Probenlösung, einem photoelektrischen Detektor und einer digitalen Anzeige oder einem Messgerät. Der detaillierte Mechanismus wird unten beschrieben. Abbildung 2 zeigt ein beispielhaftes Spektrophotometer (Modell: Spectronic 20D).

Ein Spektralfotometer besteht im Allgemeinen aus zwei Geräten; ein Spektrometer und ein Photometer. Ein Spektrometer ist ein Gerät, das Licht erzeugt, typischerweise zerstreut und misst. Ein Photometer bezeichnet den photoelektrischen Detektor, der die Lichtintensität misst.

• Spektrometer : Es erzeugt einen gewünschten Wellenlängenbereich des Lichts. Zuerst überträgt ein Kollimator (Linse) einen geraden Lichtstrahl (Photonen), der durch einen Monochromator (Prisma) geht, um ihn in mehrere Komponentenwellenlängen (Spektrum) aufzuteilen. Dann lässt ein Wellenlängenselektor (Schlitz) nur die gewünschten Wellenlängen durch, wie in Abbildung 1 gezeigt.
• Photometer : Nachdem der gewünschte Wellenlängenbereich des Lichts die Lösung einer Probe in der Küvette passiert hat, erkennt das Photometer die Menge der absorbierten Photonen und sendet dann ein Signal an ein Galvanometer oder eine Digitalanzeige, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Sie benötigen ein Spektrometer, um eine Vielzahl von Wellenlängen zu erzeugen, da verschiedene Verbindungen bei unterschiedlichen Wellenlängen am besten absorbieren. Beispielsweise hat p-Nitrophenol (Säureform) die maximale Absorption bei etwa 320 nm und p-Nitrophenolat (basische Form) absorbiert am besten bei 400 nm, wie in Abbildung 3 gezeigt.

Betrachtet man das Diagramm, das Absorption und Wellenlänge misst, kann auch ein isosbestischer Punkt beobachtet werden. Ein isosbestischer Punkt ist die Wellenlänge, bei der die Extinktion von zwei oder mehr Spezies gleich ist. Das Auftreten eines isosbestischen Punktes in einer Reaktion zeigt, dass ein Zwischenprodukt NICHT erforderlich ist, um aus einem Reaktanten ein Produkt zu bilden. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für einen isosbestischen Punkt.

Unter erneuter Bezugnahme auf Abbildung 1 (und Abbildung 5) hängt die Menge an Photonen, die durch die Küvette und in den Detektor gelangt, von der Länge der Küvette und der Konzentration der Probe ab. Sobald Sie die Intensität des Lichts kennen, nachdem es die Küvette passiert hat, können Sie es mit der Transmission (T) in Beziehung setzen. Transmission ist der Lichtanteil, der durch die Probe hindurchgeht. Dies kann mit der Gleichung berechnet werden:

\(Transmission (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Wobei I _t die Lichtintensität ist, nachdem der Lichtstrahl die Küvette passiert hat, und I _o die Lichtintensität ist, bevor der Lichtstrahl die Küvette passiert hat. Die Durchlässigkeit steht in Beziehung zur Absorption durch den Ausdruck:

\(Extinktion (A) = -log(T) = -log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Wobei Absorption für die Menge an Photonen steht, die absorbiert wird. Mit der aus der obigen Gleichung bekannten Extinktionsmenge können Sie die unbekannte Konzentration der Probe mithilfe des Beer-Lambert-Gesetzes bestimmen. Fig. 5 veranschaulicht die Lichtdurchlässigkeit durch eine Probe. Die Länge \(l\) wird für das unten beschriebene Beer-Lambert-Gesetz verwendet.

Bier-Lambert-Gesetz

Das Beer-Lambert-Gesetz (auch bekannt als Beer’s Law) besagt, dass es eine lineare Beziehung zwischen der Extinktion und der Konzentration einer Probe gibt. Aus diesem Grund kann das Beer’sche Gesetz nur angewendet werden, wenn ein linearer Zusammenhang besteht. Das Biergesetz wird wie folgt geschrieben:

\(A = ε{lc} \)

wo

• \(A\) ist das Maß der Extinktion (keine Einheiten),
• \(\epsilon\) ist der molare Extinktionskoeffizient oder der molare Absorptionsgrad (oder Absorptionskoeffizient),
• \(l\) ist die Pfadlänge, und
• \(c\) ist die Konzentration.

Der molare Extinktionskoeffizient wird als Konstante angegeben und variiert für jedes Molekül. Da die Extinktion keine Einheiten trägt, müssen die Einheiten für \(\epsilon\) die Längen- und Konzentrationseinheiten aufheben. Damit hat \(\epsilon\) die Einheit: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Die Weglänge wird in Zentimetern gemessen. Da ein Standardspektrometer eine 1 cm breite Küvette verwendet, wird \(l\) immer gleich 1 cm angenommen. Da Absorption, \(\epsilon\) und Weglänge bekannt sind, können wir die Konzentration \(c\) der Probe berechnen.

Beispiel 1

Guanosin hat eine maximale Extinktion von 275 nm. \(\Epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) und die Pfadlänge beträgt 1 cm. Mit einem Spektralfotometer finden Sie das \(A_{275} = 0,70\). Wie hoch ist die Konzentration von Guanosin?

Lösung

Um dieses Problem zu lösen, müssen Sie das Biergesetz anwenden.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Als nächstes teilen Sie beide Seiten durch [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33 x 10 ^-5 mol/l

Beispiel 2

Es gibt eine Substanz in einer Lösung (4 g/Liter). Die Länge der Küvette beträgt 2 cm und nur 50 % des bestimmten Lichtstrahls werden durchgelassen. Was ist der Absorptionskoeffizient?

Lösung

Unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes können wir den Absorptionskoeffizienten berechnen. Daher,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \Epsilon\)

Dann erhalten wir das

\(\epsilon\) = 0,0376

Beispiel 3

In Beispiel 2 oben, wie viel wird der Lichtstrahl durchgelassen, wenn 8 g/Liter ?

Lösung

Da wir \(\epsilon\) kennen, können wir die Transmission nach dem Beer-Lambert-Gesetz berechnen. Daher,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Daher \(I_t\) = 0,2503 = 25 %

Beispiel 4

Wie hoch ist in Beispiel 2 oben der molare Absorptionskoeffizient, wenn das Molekulargewicht 100 beträgt?

Lösung

Er kann einfach durch Multiplizieren des Absorptionskoeffizienten mit dem Molekulargewicht erhalten werden. Daher,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Beispiel 5

Der Absorptionskoeffizient eines Glykogen-Jod-Komplexes beträgt 0,20 bei Licht von 450 nm. Wie hoch ist die Konzentration bei einer Transmission von 40 % in einer Küvette von 2 cm?

Lösung

Es kann auch mit dem Beer-Lambert-Gesetz gelöst werden. Deswegen,

\[- \log(I_t) = – \log(0,4) = 0,20 \times c \times 2\]

Dann ist \(c\) = 0,9948

Verweise

1. Atkins, Peter und Julio de Paula. Physikalische Chemie für die Lebenswissenschaften. New York: Oxford University Press, 2006.
2. Chang, Raymond. Physikalische Chemie für die Biowissenschaften. USA: University Science Books, 2005.
3. Gore, Michael. Spektrophotometrie & Spektrofluorimetrie. New York: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas und Dwek, Raymond und Wormald, Mark. Prinzipien und Probleme der Physikalischen Chemie für Biochemiker. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. Auflage, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Mitwirkende und Zuschreibungen

• Kevin Vo (UCD)

Quelle