Wskazówki i porady dotyczące pomiarów fotometrycznych
Warto mieć na uwadze nie tylko sam proces pomiaru fotometrycznego, ale także jego konfigurację, środowisko pomiarowe i używany sprzęt.
Źródło obrazu: marodon 333/shutterstock.com
Fotometria jest powszechną, łatwą do wykonania metodą oznaczania stężeń substancji w roztworze, a także umożliwia ocenę czystości próbki. Jednak w przypadkach, gdy wartości nie mają oczywistego sensu lub znacznie się różnią, rozwiązywanie problemów może być skomplikowane. Dlatego pomocne jest wyeliminowanie możliwych źródeł błędów od samego początku i zwrócenie szczególnej uwagi na następujące kwestie podczas konfigurowania i wykonywania pomiarów fotometrycznych.
Konfiguracja i środowisko
Rozpuszczalnik
Na absorbancję próbki wpływa jej pH i siła jonowa jej rozpuszczalnika [1]. Zalecane są bufory o niskiej zawartości soli i neutralnym lub lekko zasadowym pH, które zapobiega wahaniom pH. Jednocześnie absorbancja właściwa bufora przy mierzonej długości fali powinna być niska, aby uniknąć ewentualnych ograniczeń zakresu pomiarowego.
Roztwór
W przypadku silnie stężonych roztworów próbek może być konieczne rozcieńczenie w celu utrzymania liniowego zakresu pomiaru. Idealne są rozcieńczenia w zakresie 1:10. Rozcieńczenia wyższe niż 1:50 nie są zalecane ze względu na rosnące ryzyko niedokładności wprowadzanych na tym etapie pipetowania. W zasadzie do dokładnego i precyzyjnego pipetowania należy używać skalibrowanego systemu pipet i końcówek do pipet.
Mieszanie
Po przygotowaniu rozcieńczeń, ale także po długich okresach bezruchu w próbce mogą wystąpić lokalne różnice stężeń. Dlatego ważne jest, aby dokładnie wymieszać roztwór próbki przed i po każdym etapie rozcieńczania, a także bezpośrednio przed pomiarem. Najlepsze rezultaty osiąga się poprzez worteksowanie.
Temperatura
Środowisko i fotometr, a także kuwety i próbki powinny być utrzymywane w identycznych temperaturach, aby zapobiec dryfowi mierzonych wartości.
Sprzęt i pomiary
Kuwety
Przy doborze kuwet jednym z najważniejszych czynników decydujących jest ich przezroczystość przy wymaganych długościach fal, a także kompatybilność z odpowiednim fotometrem. Obejmuje to na przykład koordynację wysokości ścieżek światła i zapewnienie, że kuwety są wypełnione wystarczającą objętością próbki. W celu uzyskania dokładnych wyników, zarówno ślepą próbę, jak i próbki, należy mierzyć w tej samej kuwecie, przy czym kuweta zawsze znajduje się w tej samej orientacji w trzonie kuwety.
Pomiar
Przed pomiarem należy zachować ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz kuwety, które zakłóciłyby drogę światła (dotyczy to zarówno ślepej próby, jak i próbek). Ustawienia fotometru muszą być odpowiednie dla wybranej metody, próbki i wybranych kuwet. Po pomiarze wszystkie wyniki należy sprawdzić pod kątem wiarygodności.
Bibliografia:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczyński P. Wpływ pH i siły jonowej na spektrofotometryczną ocenę czystości kwasu nukleinowego. BioTechniki 1997; 22:474–481.