W zastosowaniach molekularnych i biochemicznych, a także w diagnostyce medycznej, oznaczanie stężeń substancji w roztworze jest kluczowym etapem analizy. Często w tym celu stosuje się metody fotometryczne, ponieważ można je przeprowadzić łatwo i szybko, a także ponieważ często stanowią one najbardziej opłacalną opcję.

Ogólnie rzecz biorąc, metody (spektro)-fotometryczne opierają się na zasadzie, że cząsteczki w roztworze pochłaniają światło, a osłabione w ten sposób światło jest mierzone za pomocą detektora. Jak sugeruje nazwa, spektrofotometry UV/Vis wykorzystują światło widzialne i ultrafioletowe w zakresie długości fal od około 200 do 900 nm.

W celu określenia stężenia analitu najczęściej wykorzystuje się długość fali, przy której cząsteczka wykazuje najwyższą absorbancję (szczytowa długość fali). Na przykład w przypadku kwasów nukleinowych i białek byłoby to odpowiednio 260 nm i 280 nm. Podstawą obliczania stężenia substancji na podstawie pomiarów fotometrycznych są prawa fizyki opisane prawem Lamberta-Beera. Dzieje się to zgodnie z etapami wzorów wymienionych poniżej:

1. Transmisja lub transmitancja (T) = I/I ₀
   Transmisję określa się w fotometrze, wykorzystując stosunek światła wychodzącego do światła wpadającego do próbki.
2. Absorbancja (A) = log (I ₀ /I)
   Absorbancja jest obliczana z ujemnego logarytmu dziesiętnego transmisji.
3. Absorbancja (A) = C x L x Ɛ => Stężenie (C) = A/(L x Ɛ)
   Prawo Lamberta-Beera opisuje zależność absorbancji od stężenia próbki (C), długości drogi optycznej (L) oraz zależność od specyficznego dla próbki współczynnika ekstynkcji (Ɛ), który dotyczy konkretnej substancji na określonej długości fali. Stężenie próbki jest następnie obliczane poprzez przekształcenie wzoru.

Te trzy stwierdzenia opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Określenie transmisji (T = I/I ₀ )

I ₀ : Światło wchodzące do próbki
I: Światło wychodzące z próbki
C: Stężenie próbki
L: ścieżka światła/grubość próbki
Ɛ: Współczynnik ekstynkcji

Zasadniczo fotometr składa się ze źródła światła, miejsca, w którym znajduje się próbka, oraz detektora (rysunek 1). Detektor mierzy intensywność światła przechodzącego przez próbkę. Oczywiście istnieje szereg innych składników; w szczególności elementy optyczne, które załamują światło i rozdzielają je na poszczególne długości fal, a także elementy odbijające lub przepuszczające światło.

Źródło światła fotometru emituje światło o określonym natężeniu I ₀ , które jest prowadzone przez roztwór próbki. Część światła zostanie pochłonięta przez próbkę. Część, która przechodzi przez próbkę, jest rejestrowana przez detektor jako natężenie I. Stosunek I/I ₀ opisuje transmisję próbki przy określonej długości fali.

Obliczanie absorbancji (A = log (I ₀ /I)

Nowoczesne fotometry automatycznie przetwarzają transmisję próbki na absorbancję, która jest definiowana jako ujemny logarytm dziesiętny transmisji. Powstaje pytanie, dlaczego transmisja nie jest bezpośrednio wykorzystywana do obliczania stężenia próbki. Rysunek 2 wyjaśnia związek między transmisją a absorbancją. Jeśli kilka próbek, z których każda przepuszcza 50 % światła wpadającego do próbki, zostanie połączonych szeregowo, otrzymamy wykładniczą krzywą przepuszczalności, pokazaną poniżej. Jeśli zamiast tego wartości są wyrażane w sposób logarytmiczny, powstanie zależność liniowa. W ten sposób absorbancja jest proporcjonalna do stężenia (jak również do długości drogi), co znacznie upraszcza obliczenia.

Rysunek 2: Związek między przepuszczalnością a pochłanianiem światła:

Obliczanie stężenia (C = A/(L x Ɛ))

Aby wyprowadzić stężenie próbki na podstawie jej absorbancji, wymagane są dodatkowe informacje. Prawo Lamberta-Beera, które stanowi fizyczną podstawę zastosowań fotometrycznych, opisuje, że absorpcja światła przez próbkę jest wprost proporcjonalna do jej stężenia i długości drogi. Na wartość absorbancji próbki składają się łącznie trzy parametry: po pierwsze, stężenie (C) cząsteczki; po drugie, długość drogi (L) próbki, która ogólnie jest równa długości drogi kuwety. Następnie mamy współczynnik ekstynkcji (Ɛ). Współczynnik ekstynkcji jest stałą fizyczną unikalną dla cząsteczki; opisuje jego właściwość pochłaniania światła o określonej długości fali. Ta specyficzna dla materiału stała jest znana dla wielu substancji, w tym kwasów nukleinowych i różnych białek, a wartości zostały opublikowane w odpowiedniej literaturze. W takich przypadkach stężenie można określić natychmiast. Jeśli jednak wartość nie jest znana, można skorzystać z pomocy krzywej kalibracyjnej. Do wygenerowania krzywej kalibracyjnej wymagane są wzorce, czyli roztwory, które zawierają znane stężenia analizowanych substancji. Są one mierzone w fotometrze przed właściwą próbką. Stężenie analitu jest następnie obliczane przy użyciu krzywej standardowej.

Poza kwantyfikacją pomiary absorbancji mogą również ujawnić jakościowe informacje o próbce: na przykład czystość kwasów nukleinowych i białek można określić, poddając próbkę pomiarom przy dodatkowych czas.

Źródło