Dicas e Truques para Medições Fotométricas
É útil ter em mente não só o processo de medição fotométrica em si, mas também a sua configuração, o ambiente de medição e o equipamento utilizado.
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A fotometria é um método comum e facilmente realizado para a determinação das concentrações de substâncias em solução, e também é capaz de avaliar a pureza da amostra. No entanto, nos casos em que os valores não fazem sentido óbvio, ou se variam consideravelmente, a resolução de problemas pode ser complexa. Por conseguinte, é útil eliminar possíveis fontes de erro desde o início e prestar especial atenção às seguintes considerações ao configurar e efetuar medições fotométricas.
Configuração & Ambiente
Solvente
A absorvância de uma amostra é influenciada pelo seu pH e pela força iónica do seu solvente [1]. São recomendados tampão com um baixo teor de sal e um pH neutro ou ligeiramente alcalino, que previne variações no pH. Ao mesmo tempo, a absorvância inerente do tampão ao comprimento de onda a ser medido deve ser baixa, a fim de evitar possíveis limitações da gama de medição.
Diluição
No caso de soluções de amostra altamente concentradas, pode ser necessária diluição para se manter dentro da gama linear de medição. Diluições no intervalo de 1:10 são ideais. As diluições superiores a 1:50 não são recomendadas devido ao risco crescente de imprecisões introduzidas através deste passo de pipetação. Em princípio, deve ser utilizado um sistema calibrado de pipetas e pontas de pipeta para uma pipeta precisa e precisa.
Mistura
Após a preparação das diluições, mas também após longos períodos de imobilidade, podem surgir diferenças de concentração locais no seio da amostra. Por conseguinte, é importante misturar cuidadosamente a solução da amostra antes e depois de cada etapa de diluição, bem como imediatamente antes da medição. Os melhores resultados são alcançados através do vórtice.
Temperatura
O ambiente e o fotometro, assim como cuvetes e amostras, devem ser mantidos a temperaturas idênticas, a fim de evitar uma deriva dos valores medidos.
Equipamentos e Medição
Cuvettes
Ao selecionar cuvetas, a sua transparência nos comprimentos de onda necessários, bem como a sua compatibilidade com o respetivo fotómetro, estão entre os fatores decisivos mais importantes. Isto inclui, por exemplo, a coordenação das alturas dos caminhos de luz e a garantia de que os cuvetes são preenchidos com volumes de amostra suficientes. Para obter resultados precisos, o espaço em branco, bem como as amostras, devem ser medidos na mesma cuvette, com a cuvette sempre posicionada na mesma orientação no eixo cuvette.
Medição
Antes da medição, deve ter-se cuidado para evitar a formação de bolhas de ar no interior da cuvette que interrompam o caminho da luz (isto aplica-se tanto ao branco como às amostras). As definições do fotometro devem ser adequadas para o método, a amostra e os cuvetes selecionados. Após a medição, todos os resultados devem ser verificados para obter plausibilidade.
Referências:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Efeito do pH e força iónica na avaliação espectrofotométrica da pureza do ácido nucleico. BioTechniques 1997; 22:474–481.