Tipps & Tricks für photometrische Messungen
Es ist hilfreich, nicht nur das photometrische Messverfahren selbst, sondern auch dessen Aufbau, die Messumgebung und die verwendeten Geräte im Auge zu behalten.
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Die Photometrie ist eine gängige, einfach durchzuführende Methode zur Bestimmung von Konzentrationen von Stoffen in Lösung und kann auch die Probenreinheit beurteilen. In Fällen, in denen die Werte jedoch keinen offensichtlichen Sinn ergeben oder stark voneinander abweichen, kann die Fehlerbehebung komplex sein. Daher ist es hilfreich, mögliche Fehlerquellen von vornherein auszuschließen und bei der Einrichtung und Durchführung photometrischer Messungen besonders auf die folgenden Überlegungen zu achten.
Einrichtung & Umgebung
Lösungsmittel
Die Extinktion einer Probe wird durch ihren pH-Wert und die Ionenstärke ihres Lösungsmittels beeinflusst [1]. Empfehlenswert sind Puffer mit niedrigem Salzgehalt und einem neutralen oder leicht alkalischen pH-Wert, der Schwankungen des pH-Wertes vorbeugt. Gleichzeitig sollte die Eigenabsorption des Puffers bei der zu messenden Wellenlänge gering sein, um mögliche Einschränkungen des Messbereichs zu vermeiden.
Verdünnung
Bei hochkonzentrierten Probenlösungen kann eine Verdünnung erforderlich sein, um im linearen Messbereich zu bleiben. Ideal sind Verdünnungen im Bereich von 1:10. Verdünnungen über 1:50 werden aufgrund des zunehmenden Risikos von Ungenauigkeiten, die durch diesen Pipettierschritt eingeführt werden, nicht empfohlen. Grundsätzlich muss für genaues und präzises Pipettieren ein kalibriertes System aus Pipette und Pipettenspitzen verwendet werden.
Mischen
Nach Ansetzen von Verdünnungen, aber auch nach längerer Standzeit, können lokale Konzentrationsunterschiede innerhalb der Probe auftreten. Daher ist es wichtig, die Probenlösung vor und nach jedem Verdünnungsschritt sowie unmittelbar vor der Messung gründlich zu mischen. Beste Ergebnisse werden durch Vortexen erzielt.
Temperatur
Umgebung und Photometer sowie Küvetten und Proben sollten auf identischen Temperaturen gehalten werden, um ein Driften der Messwerte zu vermeiden.
Ausrüstung & Messung
Küvetten
Bei der Auswahl der Küvetten gehören deren Transparenz bei den geforderten Wellenlängen sowie die Kompatibilität mit dem jeweiligen Photometer zu den wichtigsten Entscheidungskriterien. Dazu gehört beispielsweise die Abstimmung der Höhen der Lichtwege und die Sicherstellung, dass die Küvetten mit ausreichend Probenvolumen gefüllt sind. Um genaue Ergebnisse zu erhalten, sollten sowohl der Blindwert als auch die Proben in derselben Küvette gemessen werden, wobei die Küvette immer in derselben Ausrichtung im Küvettenschacht positioniert sein sollte.
Messung
Vor der Messung muss darauf geachtet werden, dass sich keine Luftblasen in der Küvette bilden, die den Lichtweg unterbrechen würden (dies gilt sowohl für den Blindwert als auch für die Proben). Die Einstellungen des Photometers müssen der Methode, der Probe und den gewählten Küvetten entsprechen. Nach der Messung sollten alle Ergebnisse auf Plausibilität überprüft werden.
Verweise:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Einfluss von pH und Ionenstärke auf die spektrophotometrische Bestimmung der Nukleinsäurereinheit. BioTechniken 1997; 22:474–481.