Tips en trucs voor fotometrische metingen
Het is nuttig om niet alleen het fotometrische meetproces zelf in gedachten te houden, maar ook de opstelling, de meetomgeving en de gebruikte apparatuur.
Afbeeldingsbron: marodon 333/shutterstock.com
Fotometrie is een veelgebruikte, gemakkelijk uit te voeren methode voor het bepalen van concentraties van stoffen in oplossing, en het is ook in staat om de zuiverheid van monsters te beoordelen. In gevallen waarin waarden echter niet voor de hand liggend zijn, of als ze aanzienlijk variëren, kan het oplossen van problemen complex zijn. Het is daarom nuttig om mogelijke foutenbronnen van meet af aan te elimineren en speciale aandacht te besteden aan de volgende overwegingen bij het opzetten en uitvoeren van fotometrische metingen.
Opstelling & Omgeving
oplosmiddel
De absorptie van een monster wordt beïnvloed door de pH en de ionsterkte van het oplosmiddel [1]. Buffers met een laag zoutgehalte en een neutrale of licht alkalische pH, die variaties in pH voorkomen, worden aanbevolen. Tegelijkertijd moet de inherente absorptie van de buffer bij de te meten golflengte laag zijn om mogelijke beperkingen van het meetbereik te vermijden.
Verdunning
Bij sterk geconcentreerde monsteroplossingen kan verdunning nodig zijn om binnen het lineaire meetbereik te blijven. Verdunningen in het bereik van 1:10 zijn ideaal. Verdunningen hoger dan 1:50 worden niet aanbevolen vanwege het toenemende risico op onnauwkeurigheden die via deze pipetteerstap worden geïntroduceerd. Voor nauwkeurig en nauwkeurig pipetteren moet in principe een gekalibreerd systeem van pipet en pipetpunten worden gebruikt.
Mengen
Na de bereiding van verdunningen, maar ook na lange perioden van immobiliteit, kunnen er binnen het monster lokale concentratieverschillen ontstaan. Het is daarom belangrijk om de monsteroplossing grondig te mengen voor en na elke verdunningsstap, evenals onmiddellijk voorafgaand aan de meting. De beste resultaten worden bereikt door te vortexen.
Temperatuur
De omgeving en de fotometer, evenals cuvetten en monsters, moeten op identieke temperaturen worden gehouden om een afwijking van de meetwaarden te voorkomen.
Uitrusting & Meting
Cuvetten
Bij de selectie van cuvetten behoren hun transparantie bij de vereiste golflengten en hun compatibiliteit met de betreffende fotometer tot de belangrijkste beslissende factoren. Dit omvat bijvoorbeeld het afstemmen van de hoogten van de lichtpaden en het zorgen dat de cuvetten met voldoende monstervolumes worden gevuld. Om nauwkeurige resultaten te verkrijgen, moeten zowel de blanco als de monsters in dezelfde cuvet worden gemeten, waarbij de cuvet altijd in dezelfde richting in de cuvetteschacht wordt geplaatst.
Meting
Voorafgaand aan de meting moet ervoor worden gezorgd dat er geen luchtbellen in de cuvet worden gevormd die het lichtpad zouden onderbreken (dit geldt voor zowel de blanco als de monsters). De instellingen van de fotometer moeten geschikt zijn voor de methode, het monster en de geselecteerde cuvetten. Na de meting dienen alle resultaten op plausibiliteit te worden gecontroleerd.
Referenties:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Effect van pH en ionsterkte op de spectrofotometrische beoordeling van de zuiverheid van nucleïnezuren. BioTechniek 1997; 22:474-481.