No âmbito das aplicações moleculares e bioquímicas, bem como nos diagnósticos médicos, a determinação das concentrações de substâncias em solução é um passo de análise crucial. Frequentemente, os métodos fotométricos são utilizados para este fim, uma vez que estes podem ser conduzidos de forma fácil e rápida, e porque muitas vezes representam a opção mais rentável.

Em geral, os métodos fotométricos (espectro)baseiam-se no princípio de que as moléculas em solução absorvem a luz, e que a luz assim enfraquecida é medida com a ajuda de um detetor. Tal como implícito no nome, os espectrofotómetros UV/Vis utilizam a luz visível e ultravioleta na faixa de comprimento de onda entre aproximadamente 200 e 900 nm.

Para determinar a concentração de um analítico, na maioria das vezes o comprimento de onda é utilizado no qual a molécula apresenta a maior absorvância (comprimento de onda de pico). No caso dos ácidos nucleicos e das proteínas, por exemplo, seriam 260 nm e 280 nm, respectivamente. As leis da física descritas pela lei Lambert-Beer formam a base para o cálculo da concentração de uma substância a partir de medições fotométricas. Isto ocorre de acordo com os passos das fórmulas abaixo enumeradas:

1. Transmissão ou transmissão (T) = I/_I0
   A transmissão é determinada num fotometro, utilizando a relação entre a luz que sai e a luz que entra na amostra.
2. Absorvância (A) = log (_I0/I)
   A absorvância é calculada a partir do logaritmo descadico negativo da transmissão.
3. Absorvância (A) = C x L x Ɛ => Concentração (C) = A/(L x Ɛ)
   A lei Lambert-Beer descreve a dependência da absorvância na concentração da amostra (C), o comprimento do percurso ótico (L) bem como a dependência de um coeficiente de extinção específico da amostra (Ɛ), que diz respeito a uma substância específica num comprimento de onda específico. A concentração da amostra é então calculada através da conversão da fórmula.

Estas três declarações são descritas mais detalhadamente abaixo.

Determinação da transmissão (T = I/_I0)

_I0: Luz que entra na amostra
I: Luz que sai da amostra
C: Concentração da amostra
L: Caminho leve/espessura da amostra
Ɛ: Coeficiente de extinção

Basicamente, um fotometro consiste numa fonte de luz, uma posição que contém a amostra, e um detetor (figura 1). O detetor mede a intensidade da luz que viaja através da amostra. Naturalmente, estão presentes vários outros componentes; especificamente, elementos óticos que refratam a luz e a separam em comprimentos de onda individuais, bem como elementos que refletem ou transmitem a luz.

A fonte luminosa de um fotometro emite luz numa intensidade definida _I0, que é guiada através da solução da amostra. Uma parte da luz será absorvida pela amostra. A parte que atravessa a amostra é registada pelo detetor como intensidade I. A razão I/_I0 descreve a transmissão da amostra num comprimento de onda definido.

Cálculo da absorvância (A = log (_I0/I)

Os fotometros modernos convertem automaticamente a transmissão de uma amostra em absorvância, que é definida como o logaritmo decatólico negativo da transmissão. Coloca-se a questão de saber por que razão a transmissão não é diretamente utilizada para o cálculo da concentração da amostra. A figura 2 esclarece a ligação entre a transmissão e a absorvância. Se várias amostras, que cada uma permite que 50 % da luz que entra na amostra para atravessar, forem ligadas em série, a curva de transmissão exponencialmente em declínio, descrita abaixo, resultará. Se os valores forem expressos de forma logarítmica, resultará uma dependência linear. Desta forma, a absorvância é proporcional à concentração (bem como ao comprimento do percurso), o que simplifica consideravelmente os cálculos.

Figura 2: A ligação entre a transmissão e a absorvância da luz:

Cálculo da concentração (C = A/L x Ɛ))

Para obter a concentração de uma amostra da sua absorvância, são necessárias informações adicionais. A lei Lambert-Beer, que constitui a base física para aplicações fotométricas, descreve que a absorção da luz por uma amostra é diretamente proporcional à sua concentração e ao seu comprimento de percurso. Ao todo, três parâmetros contribuem para o valor de absorvância de uma amostra: primeiro, a concentração (C) da molécula; em segundo lugar, o comprimento do caminho (L) da amostra, que geralmente é igual ao comprimento do caminho da cuvette. Depois há o coeficiente de extinção (Ɛ). O coeficiente de extinção é uma constante física única à molécula; descreve a sua propriedade de absorver a luz num comprimento de onda específico. Esta constante específica do material é conhecida por uma série de substâncias, incluindo ácidos nucleicos e várias proteínas, e os valores foram publicados na literatura pertinente. Nestes casos, a concentração pode ser determinada instantaneamente. No entanto, se o valor não for conhecido, é possível recorrer à ajuda de uma curva de calibração. Para gerar uma curva de calibração, são necessárias normas, ou seja, soluções que contenham concentrações conhecidas das substâncias a analisar. Estes são medidos no fotometro antes da amostra real. A concentração da substância a analisar é então calculada utilizando a curva padrão.

Na além da quantificação, as medições de absorvância podem igualmente revelar informações qualitativas sobre a amostra: por exemplo, a pureza dos ácidos e proteínas nucleicos pode ser determinada submetendo a amostra a medições a comprimentos de onda adicionais, enquanto a informação sobre a atividade enzimática é geralmente obtida através de medições repetidas ao longo do tempo.

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