Trucs et astuces pour les mesures photométriques
Il est utile de garder à l’esprit non seulement le processus de mesure photométrique lui-même, mais également sa configuration, l’environnement de mesure et l’équipement utilisé.
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La photométrie est une méthode courante et facile à réaliser pour la détermination des concentrations de substances en solution, et elle est également capable d’évaluer la pureté de l’échantillon. Cependant, dans les cas où les valeurs n’ont pas de sens évident, ou si elles varient considérablement, le dépannage peut être complexe. Il est donc utile d’éliminer dès le départ les sources d’erreur possibles et de prêter une attention particulière aux considérations suivantes lors de la configuration et de la réalisation des mesures photométriques.
Installation et environnement
Solvant
L’absorbance d’un échantillon est influencée par son pH et la force ionique de son solvant [1]. Des tampons à faible teneur en sel et à pH neutre ou légèrement alcalin, qui évitent les variations de pH, sont recommandés. Dans le même temps, l’absorbance inhérente du tampon à la longueur d’onde mesurée doit être faible afin d’éviter d’éventuelles limitations de la plage de mesure.
Dilution
Dans le cas de solutions d’échantillon très concentrées, une dilution peut être nécessaire afin de rester dans la plage linéaire de mesure. Des dilutions de l’ordre de 1:10 sont idéales. Les dilutions supérieures à 1:50 ne sont pas recommandées en raison du risque croissant d’imprécisions introduites par cette étape de pipetage. En principe, un système calibré de pipette et de pointes de pipette doit être utilisé pour un pipetage précis et précis.
Mélange
Suite à la préparation des dilutions, mais aussi après de longues périodes d’immobilité, des différences locales de concentration peuvent apparaître au sein de l’échantillon. Il est donc important de bien mélanger la solution d’échantillon avant et après chaque étape de dilution, ainsi qu’immédiatement avant la mesure. Les meilleurs résultats sont obtenus par vortex.
Température
L’environnement et le photomètre, ainsi que les cuvettes et les échantillons, doivent être maintenus à des températures identiques afin d’éviter une dérive des valeurs mesurées.
Équipement & Mesure
Cuves
Lors de la sélection des cuvettes, leur transparence aux longueurs d’onde requises, ainsi que leur compatibilité avec le photomètre respectif, sont parmi les facteurs décisifs les plus importants. Cela comprend, par exemple, la coordination des hauteurs des trajets lumineux et la garantie que les cuvettes sont remplies de volumes d’échantillon suffisants. Afin d’obtenir des résultats précis, le blanc, ainsi que les échantillons, doivent être mesurés dans la même cuvette, la cuvette étant toujours positionnée dans la même orientation dans le puits de cuvette.
La mesure
Avant la mesure, il faut veiller à éviter la formation de bulles d’air à l’intérieur de la cuvette qui interrompraient le trajet de la lumière (ceci s’applique à la fois au blanc et aux échantillons). Les paramètres du photomètre doivent être adaptés à la méthode, à l’échantillon et aux cuvettes sélectionnés. Après la mesure, tous les résultats doivent être vérifiés quant à leur plausibilité.
Les références:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Effet du pH et de la force ionique sur l’évaluation spectrophotométrique de la pureté des acides nucléiques. BioTechniques 1997; 22:474–481.