Tippek és trükkök fotometriai mérésekhez
Nemcsak magát a fotometriai mérési folyamatot érdemes szem előtt tartani, hanem annak felépítését, a mérési környezetet és a használt berendezéseket is.
A kép forrása: marodon 333/shutterstock.com
A fotometria egy elterjedt, könnyen kivitelezhető módszer az oldatban lévő anyagok koncentrációjának meghatározására, és alkalmas a minta tisztaságának felmérésére is. Azokban az esetekben azonban, amikor az értékeknek nincs nyilvánvaló értelme, vagy ha jelentősen eltérnek, a hibaelhárítás bonyolult lehet. Ezért célszerű már eleve kiküszöbölni a lehetséges hibaforrásokat, és a fotometriai mérések beállításakor és végrehajtásakor különös figyelmet fordítani az alábbi szempontokra.
Beállítás és környezet
Oldószer
A minta abszorbanciáját a pH-ja és az oldószer ionereje befolyásolja [1]. Alacsony sótartalmú, semleges vagy enyhén lúgos pH-jú pufferek használata javasolt, amelyek megakadályozzák a pH-változást. Ugyanakkor a puffer belső abszorbanciájának a mért hullámhosszon alacsonynak kell lennie, hogy elkerüljük a mérési tartomány esetleges korlátozásait.
Hígítás
Erősen koncentrált mintaoldatok esetén a lineáris mérési tartományon belüli hígításra lehet szükség. Az 1:10 hígítási tartomány az ideális. Az 1:50-nél nagyobb hígítások nem javasoltak az e pipettázási lépés során fellépő pontatlanságok növekvő kockázata miatt. A pontos és precíz pipettázáshoz elvileg kalibrált pipettarendszert és pipettahegyeket kell használni.
Keverés
A hígítások elkészítését követően, de hosszabb ideig tartó mozdulatlanság után is helyi koncentráció-különbségek léphetnek fel a mintán belül. Ezért fontos, hogy a mintaoldatot minden hígítási lépés előtt és után, valamint közvetlenül a mérés előtt alaposan összekeverjük. A legjobb eredményt örvényléssel érjük el.
Hőfok
A környezetet és a fotométert, valamint a küvettákat és a mintákat azonos hőmérsékleten kell tartani, hogy elkerüljük a mért értékek eltolódását.
Berendezések és mérések
Küvetták
A küvetták kiválasztásánál az átlátszóságuk a kívánt hullámhosszon, valamint az adott fotométerrel való kompatibilitásuk az egyik legfontosabb döntő tényező. Ez magában foglalja például a fényutak magasságának összehangolását és annak biztosítását, hogy a küvetták megfelelő mennyiségű mintával legyenek megtelve. A pontos eredmények elérése érdekében a vakmintát és a mintákat ugyanabban a küvettában kell mérni, és a küvettát mindig ugyanabban az irányban kell elhelyezni a küvetta tengelyében.
Mérés
A mérés előtt ügyelni kell arra, hogy a küvettában ne képződjenek légbuborékok, amelyek megszakítanák a fény útját (ez mind a vakpróbára, mind a mintákra vonatkozik). A fotométer beállításainak meg kell felelniük a módszernek, a mintának és a kiválasztott küvettáknak. A mérést követően minden eredmény hitelességét ellenőrizni kell.
Referenciák:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. A pH és az ionerősség hatása a nukleinsav tisztaságának spektrofotometriás értékelésére. BioTechniques 1997; 22:474–481.