Vinkkejä ja temppuja fotometrisiin mittauksiin
On hyödyllistä pitää mielessä itse fotometrisen mittausprosessin lisäksi myös sen kokoonpano, mittausympäristö ja käytetyt laitteet.
Kuvan lähde: marodon 333/shutterstock.com
Fotometria on yleinen, helposti suoritettava menetelmä liuoksen aineiden pitoisuuksien määrittämiseen, ja sillä voidaan myös arvioida näytteen puhtautta. Tapauksissa, joissa arvoilla ei ole ilmeistä järkeä tai jos ne vaihtelevat huomattavasti, vianmääritys voi olla monimutkaista. Siksi on hyödyllistä poistaa mahdolliset virhelähteet alusta alkaen ja kiinnittää erityistä huomiota seuraaviin seikkoihin fotometrisiä mittauksia määritettäessä ja suoritettaessa.
Asetukset ja ympäristö
Liuotin
Näytteen absorbanssiin vaikuttavat sen pH ja liuottimen ionivahvuus [1]. Suosittelemme puskureita, joissa on alhainen suolapitoisuus ja neutraali tai lievästi emäksinen pH, mikä estää pH-vaihtelut. Samanaikaisesti puskurin ominaisabsorbanssin mitattavalla aallonpituudella tulee olla pieni, jotta vältytään mahdollisilta mittausalueen rajoituksilta.
Laimennus
Erittäin väkevien näyteliuosten tapauksessa laimentaminen saattaa olla tarpeen lineaarisen mittausalueen pysymiseksi. Laimennukset välillä 1:10 ovat ihanteellisia. Yli 1:50 laimennuksia ei suositella, koska tämä pipetointivaihe aiheuttaa epätarkkuuksia. Periaatteessa tarkkaa ja tarkkaa pipetointia varten on käytettävä kalibroitua pipettijärjestelmää ja pipetinkärkiä.
Sekoitus
Laimennosten valmistuksen jälkeen, mutta myös pitkän liikkumattomuuden jaksojen jälkeen näytteen sisällä voi esiintyä paikallisia pitoisuuseroja. Siksi on tärkeää sekoittaa näyteliuos perusteellisesti ennen jokaista laimennusvaihetta ja sen jälkeen sekä välittömästi ennen mittausta. Parhaat tulokset saavutetaan vorteksoimalla.
Lämpötila
Ympäristö ja fotometri sekä kyvetit ja näytteet tulee säilyttää samanlaisissa lämpötiloissa, jotta estetään mittausarvojen poikkeama.
Laitteet ja mittaukset
Kyvetit
Kyvettejä valittaessa niiden läpinäkyvyys vaadituilla aallonpituuksilla sekä yhteensopivuus kunkin fotometrin kanssa ovat tärkeimpiä ratkaisevia tekijöitä. Tämä sisältää esimerkiksi valopolkujen korkeuksien koordinoinnin ja sen varmistamisen, että kyvetit täyttyvät riittävällä näytetilavuudella. Tarkkojen tulosten saamiseksi nollanäyte ja näytteet tulee mitata samassa kyvetissä ja kyvetin ollessa aina samassa suunnassa kyvetin varressa.
Mittaus
Ennen mittausta on huolehdittava siitä, ettei kyvetin sisällä muodostu ilmakuplia, jotka katkaisevat valopolun (tämä koskee sekä nollakoetta että näytteitä). Fotometrin asetusten on vastattava menetelmää, näytettä ja valittuja kyvettejä. Mittauksen jälkeen kaikkien tulosten uskottavuus tulee tarkistaa.
Viitteet:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. pH:n ja ionivahvuuden vaikutus nukleiinihappopuhtauden spektrofotometriseen arviointiin. BioTechniques 1997; 22:474–481.