Consejos y trucos para mediciones fotométricas
Es útil tener en cuenta no solo el proceso de medición fotométrica en sí, sino también su configuración, el entorno de medición y el equipo utilizado.
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La fotometría es un método común y fácil de realizar para la determinación de concentraciones de sustancias en solución, y también es capaz de evaluar la pureza de la muestra. Sin embargo, en los casos en que los valores no tengan un sentido evidente o si varían considerablemente, la solución de problemas puede ser compleja. Por lo tanto, es útil eliminar las posibles fuentes de error desde el principio y prestar especial atención a las siguientes consideraciones al configurar y realizar mediciones fotométricas.
Configuración y entorno
Solvente
La absorbancia de una muestra está influenciada por su pH y la fuerza iónica de su solvente [1]. Se recomiendan tampones con bajo contenido en sal y pH neutro o ligeramente alcalino, que evite variaciones de pH. Al mismo tiempo, la absorbancia inherente del tampón a la longitud de onda que se mide debe ser baja para evitar posibles limitaciones del rango de medición.
Dilución
En el caso de soluciones de muestra altamente concentradas, puede ser necesaria la dilución para permanecer dentro del rango lineal de medición. Las diluciones en el rango de 1:10 son ideales. No se recomiendan diluciones superiores a 1:50 debido al creciente riesgo de imprecisiones introducidas a través de este paso de pipeteo. En principio, se debe utilizar un sistema calibrado de pipetas y puntas de pipetas para un pipeteo exacto y preciso.
mezclando
Después de la preparación de diluciones, pero también después de largos períodos de inmovilidad, pueden surgir diferencias de concentración local dentro de la muestra. Por lo tanto, es importante mezclar bien la solución de muestra antes y después de cada paso de dilución, así como inmediatamente antes de la medición. Los mejores resultados se logran mediante vórtex.
Temperatura
El entorno y el fotómetro, así como las cubetas y las muestras, deben mantenerse a temperaturas idénticas para evitar una desviación de los valores medidos.
Equipos y Medida
Cubetas
Al seleccionar cubetas, su transparencia en las longitudes de onda requeridas, así como su compatibilidad con el fotómetro respectivo, se encuentran entre los factores decisivos más importantes. Esto incluye, por ejemplo, la coordinación de las alturas de los caminos de luz y garantizar que las cubetas se llenen con volúmenes de muestra suficientes. Para obtener resultados precisos, el blanco, así como las muestras, deben medirse en la misma cubeta, con la cubeta siempre colocada en la misma orientación en el eje de la cubeta.
Medición
Antes de la medición, se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas de aire dentro de la cubeta que interrumpirían la trayectoria de la luz (esto se aplica tanto al blanco como a las muestras). Los ajustes del fotómetro deben ser apropiados para el método, la muestra y las cubetas seleccionadas. Después de la medición, se debe verificar la plausibilidad de todos los resultados.
Referencias:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Efecto del pH y la fuerza iónica en la evaluación espectrofotométrica de la pureza del ácido nucleico. BioTécnicas 1997; 22:474–481.