Suggerimenti e trucchi per misurazioni fotometriche
È utile tenere presente non solo il processo di misurazione fotometrico stesso, ma anche la sua configurazione, l’ambiente di misurazione e l’attrezzatura utilizzata.
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La fotometria è un metodo comune e di facile esecuzione per la determinazione delle concentrazioni di sostanze in soluzione ed è anche in grado di valutare la purezza del campione. Tuttavia, nei casi in cui i valori non hanno un senso evidente, o se variano considerevolmente, la risoluzione dei problemi potrebbe essere complessa. È quindi utile eliminare le possibili fonti di errore fin dall’inizio e prestare particolare attenzione alle seguenti considerazioni durante l’impostazione e l’esecuzione delle misurazioni fotometriche.
Configurazione e ambiente
Solvente
L’assorbanza di un campione è influenzata dal suo pH e dalla forza ionica del suo solvente [1]. Si consigliano tamponi a basso contenuto di sale e pH neutro o leggermente alcalino, che prevengano variazioni di pH. Allo stesso tempo, l’assorbanza intrinseca del buffer alla lunghezza d’onda da misurare dovrebbe essere bassa per evitare possibili limitazioni dell’intervallo di misurazione.
Diluizione
Nel caso di soluzioni campione altamente concentrate, può essere necessaria la diluizione per rimanere all’interno dell’intervallo lineare di misurazione. Ideali sono diluizioni nell’intervallo 1:10. Non sono consigliate diluizioni superiori a 1:50 a causa del crescente rischio di imprecisioni introdotte tramite questa fase di pipettaggio. In linea di principio, per un pipettaggio accurato e preciso deve essere utilizzato un sistema calibrato di pipette e puntali.
Miscelazione
In seguito alla preparazione delle diluizioni, ma anche dopo lunghi periodi di immobilità, possono verificarsi differenze di concentrazione locali all’interno del campione. È quindi importante miscelare accuratamente la soluzione campione prima e dopo ogni fase di diluizione, nonché immediatamente prima della misurazione. I migliori risultati si ottengono attraverso il vortex.
Temperatura
L’ambiente e il fotometro, nonché le cuvette e i campioni, devono essere mantenuti a temperature identiche per evitare una deriva dei valori misurati.
Attrezzatura e misurazione
cuvette
Quando si selezionano le cuvette, la loro trasparenza alle lunghezze d’onda richieste, nonché la loro compatibilità con il rispettivo fotometro, sono tra i fattori decisivi più importanti. Ciò include, ad esempio, il coordinamento delle altezze dei percorsi luminosi e la garanzia che le cuvette siano riempite con volumi di campione sufficienti. Per ottenere risultati accurati, il bianco, così come i campioni, devono essere misurati nella stessa cuvetta, con la cuvetta sempre posizionata con lo stesso orientamento nello stelo della cuvetta.
Misurazione
Prima della misurazione, occorre prestare attenzione per evitare la formazione di bolle d’aria all’interno della cuvetta che interromperebbero il percorso della luce (questo vale sia per il bianco che per i campioni). Le impostazioni del fotometro devono essere appropriate per il metodo, il campione e le cuvette selezionate. Dopo la misurazione, è necessario verificare la plausibilità di tutti i risultati.
Riferimenti:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Effetto del pH e della forza ionica sulla valutazione spettrofotometrica della purezza dell’acido nucleico. Biotecniche 1997; 22:474–481.