Tips och tricks för fotometriska mätningar
Det är bra att inte bara tänka på själva den fotometriska mätprocessen utan också dess uppställning, mätmiljön och den utrustning som används.
Bildkälla: marodon 333/shutterstock.com
Fotometri är en vanlig, lätt utförd metod för att bestämma koncentrationer av ämnen i lösning, och den kan också bedöma provets renhet. Men i de fall där värden inte är uppenbart meningsfulla, eller om de varierar avsevärt, kan felsökning vara komplex. Det är därför till hjälp att eliminera möjliga felkällor från början och ägna särskild uppmärksamhet åt följande överväganden när du ställer in och utför fotometriska mätningar.
Uppställning & Miljö
Lösningsmedel
Absorbansen hos ett prov påverkas av dess pH och jonstyrkan hos dess lösningsmedel [1]. Buffertar med låg salthalt och neutralt eller svagt alkaliskt pH, som förhindrar variationer i pH, rekommenderas. Samtidigt bör buffertens inneboende absorbans vid den våglängd som mäts vara låg för att undvika eventuella begränsningar av mätområdet.
Utspädning
När det gäller högkoncentrerade provlösningar kan spädning vara nödvändig för att hålla sig inom det linjära mätområdet. Spädningar i intervallet 1:10 är idealiska. Spädningar högre än 1:50 rekommenderas inte på grund av den ökande risken för felaktigheter som introduceras via detta pipetteringssteg. I princip måste ett kalibrerat system av pipett och pipettspetsar användas för noggrann och exakt pipettering.
Blandning
Efter beredning av spädningar, men även efter långa perioder av orörlighet, kan lokala koncentrationsskillnader uppstå inom provet. Det är därför viktigt att blanda provlösningen noggrant före och efter varje spädningssteg, samt omedelbart före mätning. Bästa resultat uppnås genom vortexing.
Temperatur
Miljön och fotometern, såväl som kyvetter och prover, bör hållas vid identiska temperaturer för att förhindra att de uppmätta värdena glider.
Utrustning & Mätning
Kyvetter
Vid val av kyvetter är deras transparens vid de erforderliga våglängderna, såväl som deras kompatibilitet med respektive fotometer, bland de viktigaste avgörande faktorerna. Detta inkluderar till exempel koordinering av ljusvägarnas höjder och att säkerställa att kyvetterna är fyllda med tillräckliga provvolymer. För att erhålla korrekta resultat bör blankprovet, såväl som proverna, mätas i samma kyvett, med kyvetten alltid placerad i samma riktning i kyvettskaftet.
Mått
Före mätning måste man se till att det inte bildas luftbubblor inuti kyvetten som skulle avbryta ljusvägen (detta gäller både blanket och proverna). Fotometerinställningarna måste vara lämpliga för metoden, provet och de valda kyvetterna. Efter mätningen bör alla resultat kontrolleras för rimlighet.
Referenser:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Effekt av pH och jonstyrka på den spektrofotometriska bedömningen av nukleinsyrarenhet. BioTechniques 1997; 22:474–481.