A molekuláris és biokémiai alkalmazásokon belül, valamint az orvosi diagnosztikában az oldatban lévő anyagok koncentrációjának meghatározása kulcsfontosságú elemzési lépés. Gyakran fotometriai módszereket alkalmaznak erre a célra, mivel ezek könnyen és gyorsan végrehajthatók, és gyakran a legköltséghatékonyabb megoldást jelentik.

A (spektro)fotometriás módszerek általában azon az elven alapulnak, hogy az oldatban lévő molekulák elnyelik a fényt, és az így gyengített fényt detektor segítségével mérik. Amint az a névből is következik, az UV/Vis spektrofotométerek látható és ultraibolya fényt használnak körülbelül 200 és 900 nm közötti hullámhossz-tartományban.

Az analit koncentrációjának meghatározásához leggyakrabban azt a hullámhosszt használják, amelynél a molekula a legnagyobb abszorbanciát (csúcshullámhosszt) mutatja. Például nukleinsavak és fehérjék esetében ez 260 nm, illetve 280 nm lenne. A Lambert-Beer törvény által leírt fizika törvényei képezik az alapját egy anyag koncentrációjának fotometriai mérésekből történő kiszámításának. Ez az alábbi képletek lépései szerint történik:

1. Átvitel vagy áteresztőképesség (T) = I/I ₀
   Az átvitelt fotométerben határozzák meg, a mintába kilépő és a mintába belépő fény arányának felhasználásával.
2. Abszorbancia (A) = log (I ₀ /I)
   Az abszorbanciát az átvitel negatív dekadikus logaritmusából számítják ki.
3. Abszorbancia (A) = C x L x Ɛ => Koncentráció (C) = A/(L x Ɛ)
   A Lambert-Beer törvény leírja az abszorbancia függését a minta koncentrációjától (C), az optikai út hosszától (L), valamint a mintaspecifikus extinkciós együtthatótól (Ɛ) való függést, amely egy adott anyagra vonatkozik. meghatározott hullámhosszon. A mintakoncentrációt ezután a képlet átalakításával számítják ki.

Ezt a három állítást az alábbiakban részletesebben ismertetjük.

Az átvitel meghatározása (T = I/I ₀ )

1. ábra: A mintát és a Lambert-Beer törvénye szempontjából releváns paramétereket ábrázoló fotométer egyszerűsített összeállítása

I ₀ : Fény belép a mintába
I: Fény kilép a mintából
C: A minta koncentrációja
L: A minta fényútja/vastagsága
Ɛ: Kioltási együttható

A fotométer alapvetően egy fényforrásból, egy, a mintát tartó pozícióból és egy detektorból áll (1. ábra). A detektor méri a mintán áthaladó fény intenzitását. Természetesen számos egyéb összetevő is jelen van; konkrétan olyan optikai elemek, amelyek megtörik a fényt és egyedi hullámhosszokra választják szét, valamint olyan elemek, amelyek visszaverik vagy továbbítják a fényt.

A fotométer fényforrása meghatározott intenzitású I ₀ fényt bocsát ki, amely a mintaoldaton keresztül vezet. A fény egy részét a minta elnyeli. A mintán áthaladó részt a detektor I-es intenzitásként regisztrálja. Az I/I ₀ arány a minta átvitelét írja le meghatározott hullámhosszon.

Az abszorbancia számítása (A = log (I ₀ /I)

A modern fotométerek automatikusan átalakítják a minta transzmisszióját abszorbanciává, amelyet az átvitel negatív dekadikus logaritmusaként határoznak meg. Felmerül a kérdés, hogy miért nem használják közvetlenül az átvitelt a mintakoncentráció számításánál. A 2. ábra tisztázza az átvitel és az abszorbancia közötti kapcsolatot. Ha több mintát, amelyek mindegyike lehetővé teszi a mintába belépő fény 50%-ának áthaladását, sorba kapcsolunk, akkor az alábbiakban bemutatott exponenciálisan csökkenő átviteli görbe jön létre. Ha az értékeket ehelyett logaritmikus módon fejezzük ki, akkor lineáris függőség keletkezik. Ily módon az abszorbancia arányos a koncentrációval (valamint az úthosszal), ami jelentősen leegyszerűsíti a számításokat.

2. ábra: A fényáteresztés és a fényelnyelés kapcsolata:

a) Sorba kell kapcsolni a mintákat, amelyek mindegyike lehetővé teszi a mintába belépő fény 50%-ának áteresztését. A százalék a kezdeti fényintenzitásra vonatkozik.

b) Exponenciálisan csökkenő átviteli görbe

c) Az abszorbancia grafikus ábrázolása (az átvitel dekadikus logaritmusának felhasználásával)

A koncentráció kiszámítása (C = A/(L x Ɛ))

Ahhoz, hogy a minta koncentrációját az abszorbanciájából lehessen levezetni, további információkra van szükség. A Lambert-Beer törvény, amely a fotometriai alkalmazások fizikai alapját képezi, leírja, hogy a minta fényelnyelése egyenesen arányos a minta koncentrációjával és úthosszával. Összességében három paraméter járul hozzá a minta abszorbancia értékéhez: először is a molekula koncentrációja (C); másodszor, a minta úthossza (L), amely általában megegyezik a küvetta úthosszával. Aztán ott van az extinkciós együttható (Ɛ). Az extinkciós együttható a molekulára jellemző egyedi fizikai állandó; azt a tulajdonságát írja le, hogy adott hullámhosszon elnyeli a fényt. Ez az anyagspecifikus állandó számos anyag, köztük nukleinsavak és különféle fehérjék esetében ismert, és az értékeket a vonatkozó szakirodalomban publikálták. Ezekben az esetekben a koncentráció azonnal meghatározható. Ha azonban az érték nem ismert, akkor lehetőség van egy kalibrációs görbe segítségére. A kalibrációs görbe létrehozásához standardok szükségesek, azaz olyan oldatok, amelyek ismert koncentrációban tartalmazzák a vizsgálandó anyagokat. Ezeket a fotométerben mérik a tényleges mintavétel előtt. Ezután a standard görbe segítségével kiszámítjuk az analit koncentrációját.

A mennyiségi meghatározás mellett az abszorbancia mérések kvalitatív információkat is feltárhatnak a mintáról: például a nukleinsavak és fehérjék tisztasága meghatározható úgy, hogy a mintát további hullámhosszakon mérik, míg az enzimaktivitásra vonatkozó információkat általában ismételt mérésekkel nyerik. idő.

Forrás