Binnen moleculaire en biochemische toepassingen, maar ook in de medische diagnostiek, is het bepalen van de concentraties van stoffen in oplossing een cruciale analysestap. Vaak worden hiervoor fotometrische methoden gebruikt, omdat deze gemakkelijk en snel kunnen worden uitgevoerd en omdat ze vaak de meest kosteneffectieve optie zijn.

In het algemeen zijn (spectro)fotometrische methoden gebaseerd op het principe dat moleculen in oplossing licht absorberen, en dat het aldus verzwakte licht wordt gemeten met behulp van een detector. Zoals de naam al aangeeft, gebruiken UV/Vis-spectrofotometers zichtbaar en ultraviolet licht in het golflengtebereik tussen ongeveer 200 en 900 nm.

Om de concentratie van een analyt te bepalen, wordt meestal de golflengte gebruikt waarbij het molecuul de hoogste absorptie vertoont (piekgolflengte). In het geval van bijvoorbeeld nucleïnezuren en eiwitten zou dit respectievelijk 260 nm en 280 nm zijn. De natuurkundige wetten beschreven door de wet van Lambert-Beer vormen de basis voor de berekening van de concentratie van een stof uit fotometrische metingen. Dit gebeurt volgens de stappen van de onderstaande formules:

1. Transmissie of transmissie (T) = I/I ₀
   De transmissie wordt bepaald in een fotometer, met behulp van de verhouding tussen het licht dat naar buiten gaat en het licht dat het monster binnenkomt.
2. Absorptie (A) = log (I ₀ /I)
   Absorptie wordt berekend uit de negatieve tientallige logaritme van transmissie.
3. Absorptie (A) = C x L x Ɛ => Concentratie (C) = A/(L x Ɛ)
   De wet van Lambert-Beer beschrijft de afhankelijkheid van de absorptie van de concentratie van het monster (C), de optische weglengte (L) en de afhankelijkheid van een monsterspecifieke extinctiecoëfficiënt (Ɛ), die betrekking heeft op een specifieke stof op een bepaalde golflengte. De monsterconcentratie wordt vervolgens berekend door de formule om te zetten.

Deze drie uitspraken worden hieronder in meer detail beschreven.

Bepaling van transmissie (T = I/I ₀ )

Figuur 1: Vereenvoudigde montage van een fotometer die het monster en parameters weergeeft die relevant zijn voor de wet van Lambert-Beer

I ₀ : Licht dat het monster binnenkomt
I: Licht dat uit het monster komt
C: Concentratie van het monster
L: Lichtpad/dikte van het monster
Ɛ: Uitstervingscoëfficiënt

In principe bestaat een fotometer uit een lichtbron, een positie die het monster vasthoudt en een detector (figuur 1). De detector meet de intensiteit van het licht dat door het monster gaat. Uiteraard zijn er nog een aantal andere componenten aanwezig; in het bijzonder optische elementen die het licht breken en scheiden in afzonderlijke golflengten, evenals elementen die het licht reflecteren of doorlaten.

De lichtbron van een fotometer zendt licht uit met een gedefinieerde intensiteit I ₀ , dat door de monsteroplossing wordt geleid. Een deel van het licht wordt door het monster geabsorbeerd. Het gedeelte dat door het monster gaat, wordt door de detector geregistreerd als intensiteit I. De verhouding I/I ₀ beschrijft de transmissie van het monster bij een gedefinieerde golflengte.

Berekening van de absorptie (A = log (I ₀ /I)

Moderne fotometers zetten de transmissie van een monster automatisch om in absorptie, wat wordt gedefinieerd als de negatieve tientallige logaritme van transmissie. De vraag rijst waarom transmissie niet direct wordt gebruikt voor de berekening van de monsterconcentratie. Figuur 2 verduidelijkt het verband tussen transmissie en absorptie. Als meerdere monsters, die elk 50 % van het licht dat het monster binnenkomt doorlaten, in serie worden geschakeld, ontstaat de exponentieel afnemende transmissiecurve, zoals hieronder weergegeven. Als de waarden in plaats daarvan op een logaritmische manier worden uitgedrukt, resulteert dit in een lineaire afhankelijkheid. Op deze manier is de absorptie evenredig met de concentratie (evenals de padlengte), wat de berekeningen aanzienlijk vereenvoudigt.

Figuur 2: Het verband tussen transmissie en absorptie van licht:

a) Monsters in serie aansluiten, die elk 50 % van het licht dat het monster binnenkomt doorlaten. Het percentage heeft betrekking op de initiële lichtintensiteit.

b) Exponentieel dalende transmissiecurve

c) Grafische weergave van de absorptie (gebruikmakend van de tientallige logaritme van transmissie)

Berekening van de concentratie (C = A/(L x Ɛ))

Om de concentratie van een monster uit zijn absorptie af te leiden, is aanvullende informatie vereist. De wet van Lambert-Beer, die de fysieke basis vormt voor fotometrische toepassingen, beschrijft dat de absorptie van licht door een monster recht evenredig is met de concentratie en de padlengte. In totaal dragen drie parameters bij aan de absorptiewaarde van een monster: ten eerste de concentratie (C) van het molecuul; ten tweede de padlengte (L) van het monster, die in het algemeen gelijk is aan de padlengte van de cuvet. Dan is er nog de extinctiecoëfficiënt (Ɛ). De extinctiecoëfficiënt is een fysieke constante die uniek is voor het molecuul; het beschrijft zijn eigenschap om licht op een specifieke golflengte te absorberen. Deze materiaalspecifieke constante is bekend van een aantal stoffen, waaronder nucleïnezuren en verschillende eiwitten, en de waarden zijn gepubliceerd in de relevante literatuur. In deze gevallen kan de concentratie direct worden bepaald. Als de waarde echter niet bekend is, is het mogelijk om de hulp van een kalibratiecurve in te roepen. Om een calibratiecurve te maken zijn standaarden nodig, dat wil zeggen oplossingen die bekende concentraties van de te analyseren stoffen bevatten. Deze worden voorafgaand aan het eigenlijke monster in de fotometer gemeten. De concentratie van de analyt wordt vervolgens berekend met behulp van de standaardcurve.

Naast kwantificering kunnen absorptiemetingen ook kwalitatieve informatie over het monster onthullen: de zuiverheid van nucleïnezuren en eiwitten kan bijvoorbeeld worden bepaald door het monster te onderwerpen aan metingen bij aanvullende golflengten, terwijl informatie over enzymactiviteit over het algemeen wordt verkregen door herhaalde metingen gedurende tijd.

Bron