All’interno delle applicazioni molecolari e biochimiche, così come nella diagnostica medica, la determinazione delle concentrazioni di sostanze in soluzione è un passaggio cruciale dell’analisi. Spesso a questo scopo vengono impiegati metodi fotometrici, in quanto possono essere eseguiti facilmente e rapidamente e poiché rappresentano spesso l’opzione più conveniente.

In generale, i metodi (spettro)-fotometrici si basano sul principio che le molecole in soluzione assorbono la luce e che la luce così indebolita viene misurata con l’aiuto di un rivelatore. Come implicito nel nome, gli spettrofotometri UV/Vis utilizzano la luce visibile e ultravioletta nell’intervallo di lunghezze d’onda tra circa 200 e 900 nm.

Per determinare la concentrazione di un analita, il più delle volte viene utilizzata la lunghezza d’onda alla quale la molecola mostra la massima assorbanza (lunghezza d’onda di picco). Nel caso degli acidi nucleici e delle proteine, ad esempio, questo sarebbe rispettivamente di 260 nm e 280 nm. Le leggi della fisica descritte dalla legge di Lambert-Beer costituiscono la base per il calcolo della concentrazione di una sostanza da misurazioni fotometriche. Ciò avviene secondo i passaggi delle formule elencate di seguito:

1. Trasmissione o trasmittanza (T) = I/I ₀
   La trasmissione è determinata in un fotometro, utilizzando il rapporto tra la luce che esce e la luce che entra nel campione.
2. Assorbanza (A) = log (I ₀ /I)
   L’assorbanza è calcolata dal logaritmo decennale negativo della trasmissione.
3. Assorbanza (A) = C x L x Ɛ => Concentrazione (C) = A/(L x Ɛ)
   La legge di Lambert-Beer descrive la dipendenza dell’assorbanza dalla concentrazione del campione (C), dalla lunghezza del percorso ottico (L) e dalla dipendenza da un coefficiente di estinzione specifico del campione (Ɛ), che appartiene a una sostanza specifica ad una determinata lunghezza d’onda. La concentrazione del campione viene quindi calcolata convertendo la formula.

Queste tre affermazioni sono descritte più dettagliatamente di seguito.

Determinazione della trasmissione (T = I/I ₀ )

Figura 1: Assemblaggio semplificato di un fotometro raffigurante il campione e i parametri rilevanti per la legge di Lambert-Beer

I ₀ : Luce che entra nel campione
I: Luce in uscita dal campione
C: Concentrazione del campione
L: Percorso ottico/spessore del campione
Ɛ: Coefficiente di estinzione

Fondamentalmente, un fotometro è costituito da una sorgente luminosa, una posizione che trattiene il campione e un rivelatore (figura 1). Il rivelatore misura l’intensità della luce che viaggia attraverso il campione. Naturalmente sono presenti numerosi altri componenti; in particolare, elementi ottici che rifrangono la luce e la separano in singole lunghezze d’onda, nonché elementi che riflettono o trasmettono la luce.

La sorgente luminosa di un fotometro emette luce a un’intensità definita I ₀ , che viene guidata attraverso la soluzione campione. Una parte della luce sarà assorbita dal campione. La parte che attraversa il campione viene registrata dal rivelatore come intensità I. Il rapporto I/I ₀ descrive la trasmissione del campione ad una lunghezza d’onda definita.

Calcolo dell’assorbanza (A = log (I ₀ /I)

I moderni fotometri convertono automaticamente la trasmissione di un campione in assorbanza, che è definita come il logaritmo decennale negativo della trasmissione. Sorge la domanda sul perché la trasmissione non sia utilizzata direttamente per il calcolo della concentrazione del campione. La figura 2 chiarisce la connessione tra trasmissione e assorbanza. Se più campioni, ciascuno dei quali permette al 50 % della luce che entra nel campione di attraversare, sono collegati in serie, risulterà la curva di trasmissione in diminuzione esponenziale, illustrata di seguito. Se invece i valori sono espressi in modo logaritmico, risulterà una dipendenza lineare. In questo modo, l’assorbanza è proporzionale alla concentrazione (così come alla lunghezza del percorso), il che semplifica notevolmente i calcoli.

Figura 2: La connessione tra trasmissione e assorbanza della luce:

a) Collegare i campioni in serie, ciascuno dei quali consente la trasmissione del 50 % della luce che entra nel campione. La percentuale si riferisce all’intensità luminosa iniziale.

b) Curva di trasmissione decrescente esponenzialmente

c) Rappresentazione grafica dell’assorbanza (utilizzando il logaritmo decennale di trasmissione)

Calcolo della concentrazione (C = A/(L x Ɛ))

Per ricavare la concentrazione di un campione dalla sua assorbanza, sono necessarie ulteriori informazioni. La legge di Lambert-Beer, che costituisce la base fisica per le applicazioni fotometriche, descrive che l’assorbimento di luce da parte di un campione è direttamente proporzionale alla sua concentrazione e alla sua lunghezza del percorso. Complessivamente, tre parametri contribuiscono al valore di assorbanza di un campione: primo, la concentrazione (C) della molecola; secondo, la lunghezza del percorso (L) del campione, che generalmente è uguale alla lunghezza del percorso della cuvetta. Poi c’è il coefficiente di estinzione (Ɛ). Il coefficiente di estinzione è una costante fisica unica della molecola; descrive la sua proprietà di assorbire la luce a una specifica lunghezza d’onda. Questa costante specifica del materiale è nota per un certo numero di sostanze, inclusi acidi nucleici e varie proteine, ei valori sono stati pubblicati nella letteratura pertinente. In questi casi, la concentrazione può essere determinata istantaneamente. Se il valore non è noto, tuttavia, è possibile avvalersi dell’aiuto di una curva di calibrazione. Per generare una curva di calibrazione sono necessari degli standard, ovvero soluzioni che contengano concentrazioni note delle sostanze da analizzare. Questi vengono misurati nel fotometro prima del campione effettivo. La concentrazione dell’analita viene quindi calcolata utilizzando la curva standard.

Oltre alla quantificazione, le misurazioni dell’assorbanza possono anche rivelare informazioni qualitative sul campione: ad esempio, la purezza degli acidi nucleici e delle proteine può essere determinata sottoponendo il campione a misurazioni a lunghezze d’onda aggiuntive, mentre le informazioni sull’attività enzimatica sono generalmente ottenute attraverso misurazioni ripetute su volta.

Fonte