Inom molekylära och biokemiska tillämpningar, såväl som inom medicinsk diagnostik, är bestämning av koncentrationerna av ämnen i lösning ett avgörande analyssteg. Ofta används fotometriska metoder för detta ändamål, eftersom dessa kan utföras enkelt och snabbt, och eftersom de ofta representerar det mest kostnadseffektiva alternativet.

I allmänhet bygger (spektro)fotometriska metoder på principen att molekyler i lösning absorberar ljus, och att det därmed försvagade ljuset mäts med hjälp av en detektor. Som antyds i namnet använder UV/Vis-spektrofotometrar synligt och ultraviolett ljus i våglängdsintervallet mellan cirka 200 och 900 nm.

För att bestämma koncentrationen av en analyt används oftast den våglängd vid vilken molekylen uppvisar den högsta absorbansen (toppvåglängden). I fallet med nukleinsyror och proteiner, till exempel, skulle detta vara 260 nm respektive 280 nm. Fysikens lagar som beskrivs av Lambert-Beers lag utgör grunden för beräkningen av koncentrationen av ett ämne från fotometriska mätningar. Detta sker enligt stegen i formlerna nedan:

1. Överföring eller överföring (T) = I/I ₀
   Transmissionen bestäms i en fotometer, med hjälp av förhållandet mellan ljuset som kommer ut och ljuset som kommer in i provet.
2. Absorbans (A) = log (I ₀ /I)
   Absorbansen beräknas från den negativa dekadiska logaritmen för transmission.
3. Absorbans (A) = C x L x Ɛ => Koncentration (C) = A/(L x Ɛ)
   Lambert-Beer-lagen beskriver absorbansens beroende av koncentrationen av provet (C), den optiska väglängden (L) samt beroendet av en provspecifik extinktionskoefficient (Ɛ), som hänför sig till ett specifikt ämne vid en specifik våglängd. Provkoncentrationen beräknas sedan genom att konvertera formeln.

Dessa tre uttalanden beskrivs mer i detalj nedan.

Bestämning av överföring (T = I/I ₀ )

Figur 1: Förenklad montering av en fotometer som visar provet och parametrar som är relevanta för lagen om Lambert-Beer

I ₀ : Ljus som kommer in i provet
I: Ljus som lämnar provet
C: Koncentration av provet
L: Ljusväg/tjocklek på provet
Ɛ: Extinktionskoefficient

I grund och botten består en fotometer av en ljuskälla, en position som håller provet och en detektor (figur 1). Detektorn mäter intensiteten av ljuset som färdas genom provet. Naturligtvis finns ett antal andra komponenter närvarande; specifikt optiska element som bryter ljuset och separerar det i individuella våglängder såväl som element som reflekterar eller transmitterar ljuset.

En fotometers ljuskälla avger ljus med en definierad intensitet I ₀ , som leds genom provlösningen. En del av ljuset kommer att absorberas av provet. Den del som passerar provet registreras av detektorn som intensitet I. Förhållandet I/I ₀ beskriver överföringen av provet vid en definierad våglängd.

Beräkning av absorbans (A = log (I ₀ /I)

Moderna fotometrar omvandlar automatiskt överföringen av ett prov till absorbans, vilket definieras som den negativa dekadiska logaritmen för överföringen. Frågan uppstår varför transmission inte direkt används för beräkning av provkoncentration. Figur 2 klargör sambandet mellan transmission och absorbans. Om flera prover, som var och en tillåter 50 % av ljuset som kommer in i provet att passera, kopplas i serie, kommer den exponentiellt minskande transmissionskurvan, som visas nedan, att resultera. Om värdena istället uttrycks på ett logaritmiskt sätt, uppstår ett linjärt beroende. På så sätt är absorbansen proportionell mot koncentrationen (liksom väglängden), vilket förenklar beräkningarna avsevärt.

Figur 2: Sambandet mellan transmission och absorbans av ljus:

a) Ansluta prover i serie, som vart och ett tillåter överföring av 50 % av ljuset som kommer in i provet. Procentandelen avser den initiala ljusintensiteten.

b) Exponentiellt fallande transmissionskurva

c) Grafisk representation av absorbansen (med användning av den dekadiska logaritmen för transmission)

Beräkning av koncentration (C = A/(L x Ɛ))

För att härleda koncentrationen av ett prov från dess absorbans krävs ytterligare information. Lambert-Beer-lagen, som utgör den fysiska grunden för fotometriska tillämpningar, beskriver att absorptionen av ljus av ett prov är direkt proportionell mot dess koncentration och dess väglängd. Sammantaget bidrar tre parametrar till absorbansvärdet för ett prov: för det första, koncentrationen (C) av molekylen; för det andra provets banlängd (L), som i allmänhet är lika med kyvettens banlängd. Sedan finns det extinktionskoefficienten (Ɛ). Extinktionskoefficienten är en fysisk konstant som är unik för molekylen; den beskriver dess egenskap att absorbera ljus vid en specifik våglängd. Denna materialspecifika konstant är känd för ett antal ämnen, inklusive nukleinsyror och olika proteiner, och värdena har publicerats i relevant litteratur. I dessa fall kan koncentrationen bestämmas omedelbart. Om värdet inte är känt är det dock möjligt att ta hjälp av en kalibreringskurva. För att generera en kalibreringskurva krävs standarder, det vill säga lösningar som innehåller kända koncentrationer av de ämnen som ska analyseras. Dessa mäts i fotometern före själva provet. Koncentrationen av analyten beräknas sedan med användning av standardkurvan.

Utöver kvantifiering kan absorbansmätningar också avslöja kvalitativ information om provet: till exempel kan renheten hos nukleinsyror och proteiner bestämmas genom att utsätta provet för mätningar vid ytterligare våglängder, medan information om enzymaktivitet vanligtvis erhålls genom upprepade mätningar över tid.

Källa