Dans les applications moléculaires et biochimiques, ainsi que dans les diagnostics médicaux, la détermination des concentrations de substances en solution est une étape d’analyse cruciale. Souvent, des méthodes photométriques sont utilisées à cette fin, car elles peuvent être réalisées facilement et rapidement, et parce qu’elles représentent souvent l’option la plus rentable.

En général, les méthodes (spectro)-photométriques sont basées sur le principe que les molécules en solution absorbent la lumière, et que la lumière ainsi affaiblie est mesurée à l’aide d’un détecteur. Comme leur nom l’indique, les spectrophotomètres UV/Vis utilisent la lumière visible et ultraviolette dans la gamme de longueurs d’onde comprise entre environ 200 et 900 nm.

Afin de déterminer la concentration d’un analyte, le plus souvent la longueur d’onde est utilisée à laquelle la molécule affiche l’absorbance la plus élevée (longueur d’onde maximale). Dans le cas des acides nucléiques et des protéines, par exemple, ce serait 260 nm et 280 nm, respectivement. Les lois de la physique décrites par la loi de Lambert-Beer constituent la base du calcul de la concentration d’une substance à partir de mesures photométriques. Cela se produit selon les étapes des formules énumérées ci-dessous :

1. Transmission ou transmittance (T) = I/I ₀
   La transmission est déterminée dans un photomètre, en utilisant le rapport entre la lumière qui sort et la lumière qui entre dans l’échantillon.
2. Absorbance (A) = log (I ₀ /I)
   L’absorbance est calculée à partir du logarithme décadique négatif de la transmission.
3. Absorbance (A) = C x L x Ɛ => Concentration (C) = A/(L x Ɛ)
   La loi de Lambert-Beer décrit la dépendance de l’absorbance à la concentration de l’échantillon (C), la longueur du chemin optique (L) ainsi que la dépendance à un coefficient d’extinction spécifique à l’échantillon (Ɛ), qui se rapporte à une substance spécifique à une longueur d’onde spécifique. La concentration de l’échantillon est ensuite calculée en convertissant la formule.

Ces trois déclarations sont décrites plus en détail ci-dessous.

Détermination de la transmission (T = I/I ₀ )

Figure 1 : Montage simplifié d’un photomètre représentant l’échantillon et les paramètres pertinents pour la loi de Lambert-Beer

I ₀ : Lumière entrant dans l’échantillon
I : Lumière sortant de l’échantillon
C : Concentration de l’échantillon
L : trajet lumineux/épaisseur de l’échantillon
Ɛ : Coefficient d’extinction

Fondamentalement, un photomètre se compose d’une source lumineuse, d’une position qui maintient l’échantillon et d’un détecteur (figure 1). Le détecteur mesure l’intensité de la lumière qui traverse l’échantillon. Naturellement, un certain nombre d’autres composants sont présents ; spécifiquement, des éléments optiques qui réfractent la lumière et la séparent en longueurs d’onde individuelles ainsi que des éléments qui réfléchissent ou transmettent la lumière.

La source lumineuse d’un photomètre émet de la lumière à une intensité définie I ₀ , qui est guidée à travers la solution d’échantillon. Une partie de la lumière sera absorbée par l’échantillon. La partie qui traverse l’échantillon est enregistrée par le détecteur comme intensité I. Le rapport I/I ₀ décrit la transmission de l’échantillon à une longueur d’onde définie.

Calcul de l’absorbance (A = log (I ₀ /I)

Les photomètres modernes convertissent automatiquement la transmission d’un échantillon en absorbance, qui est définie comme le logarithme décadique négatif de la transmission. La question se pose de savoir pourquoi la transmission n’est pas directement utilisée pour le calcul de la concentration de l’échantillon. La figure 2 clarifie le lien entre la transmission et l’absorbance. Si plusieurs échantillons, qui permettent chacun à 50 % de la lumière qui pénètre dans l’échantillon de traverser, sont connectés en série, la courbe de transmission en déclin exponentiel, illustrée ci-dessous, en résultera. Si les valeurs sont plutôt exprimées de manière logarithmique, une dépendance linéaire en résultera. De cette manière, l’absorbance est proportionnelle à la concentration (ainsi qu’à la longueur du trajet), ce qui simplifie considérablement les calculs.

Figure 2 : Le lien entre la transmission et l’absorbance de la lumière :

a) Connecter des échantillons en série, chacun d’entre eux permettant la transmission de 50 % de la lumière qui pénètre dans l’échantillon. Le pourcentage se rapporte à l’intensité lumineuse initiale.

b) Courbe de transmission en déclin exponentiel

c) Représentation graphique de l’absorbance (utilisant le logarithme décadique de transmission)

Calcul de la concentration (C = A/(L x Ɛ))

Afin de dériver la concentration d’un échantillon à partir de son absorbance, des informations supplémentaires sont nécessaires. La loi de Lambert-Beer, qui constitue la base physique des applications photométriques, décrit que l’absorption de la lumière par un échantillon est directement proportionnelle à sa concentration et à sa longueur de trajet. Au total, trois paramètres contribuent à la valeur d’absorbance d’un échantillon : premièrement, la concentration (C) de la molécule ; deuxièmement, la longueur du trajet (L) de l’échantillon, qui est généralement égale à la longueur du trajet de la cuvette. Ensuite, il y a le coefficient d’extinction (Ɛ). Le coefficient d’extinction est une constante physique unique à la molécule ; il décrit sa propriété d’absorber la lumière à une longueur d’onde spécifique. Cette constante spécifique au matériau est connue pour un certain nombre de substances, y compris les acides nucléiques et diverses protéines, et les valeurs ont été publiées dans la littérature pertinente. Dans ces cas, la concentration peut être déterminée instantanément. Si la valeur n’est pas connue, il est toutefois possible de s’aider d’une courbe d’étalonnage. Afin de générer une courbe d’étalonnage, des standards sont nécessaires, c’est-à-dire des solutions qui contiennent des concentrations connues des substances à analyser. Ceux-ci sont mesurés dans le photomètre avant l’échantillon réel. La concentration de l’analyte est ensuite calculée à l’aide de la courbe standard.

Outre la quantification, les mesures d’absorbance peuvent également révéler des informations qualitatives sur l’échantillon : par exemple, la pureté des acides nucléiques et des protéines peut être déterminée en soumettant l’échantillon à des mesures à des longueurs d’onde supplémentaires, alors que les informations sur l’activité enzymatique sont généralement obtenues par des mesures répétées sur temps.

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