Molekyyli- ja biokemiallisissa sovelluksissa sekä lääketieteellisessä diagnostiikassa aineiden pitoisuuksien määrittäminen liuoksessa on ratkaiseva analyysivaihe. Usein tähän tarkoitukseen käytetään fotometrisiä menetelmiä, koska ne voidaan suorittaa helposti ja nopeasti ja koska ne ovat usein kustannustehokkain vaihtoehto.

Yleisesti (spektro)fotometriset menetelmät perustuvat siihen periaatteeseen, että liuoksessa olevat molekyylit absorboivat valoa ja että näin heikentynyt valo mitataan detektorin avulla. Kuten nimestä käy ilmi, UV/Vis-spektrofotometrit käyttävät näkyvää ja ultraviolettivaloa aallonpituusalueella noin 200-900 nm.

Analyytin pitoisuuden määrittämiseksi käytetään useimmiten sitä aallonpituutta, jolla molekyylillä on suurin absorbanssi (huippuaallonpituus). Esimerkiksi nukleiinihappojen ja proteiinien tapauksessa tämä olisi 260 nm ja 280 nm, vastaavasti. Lambert-Beerin lain kuvaamat fysiikan lait muodostavat perustan aineen pitoisuuden laskemiselle fotometrisista mittauksista. Tämä tapahtuu alla lueteltujen kaavojen vaiheiden mukaisesti:

1. Transmissio tai läpäisykyky (T) = I/I ₀
   Läpäisy määritetään fotometrissä käyttämällä ulos tulevan valon ja näytteeseen tulevan valon suhdetta.
2. Absorbanssi (A) = log (I ₀ /I)
   Absorbanssi lasketaan lähetyksen negatiivisesta dekadisesta logaritmista.
3. Absorbanssi (A) = C x L x Ɛ => Pitoisuus (C) = A/(L x Ɛ)
   Lambert-Beer-laki kuvaa absorbanssin riippuvuutta näytteen pitoisuudesta (C), optisen polun pituudesta (L) sekä riippuvuutta näytekohtaisesta ekstinktiokerroimesta (Ɛ), joka koskee tiettyä ainetta. tietyllä aallonpituudella. Näytteen pitoisuus lasketaan sitten muuntamalla kaava.

Näitä kolmea lausuntoa kuvataan yksityiskohtaisemmin alla.

Lähetyksen määritys (T = I/I ₀ )

Kuva 1: Fotometrin yksinkertaistettu kokoonpano, joka kuvaa näytettä ja parametreja, jotka ovat merkityksellisiä Lambert-Beerin lain kannalta

I ₀ : Valo tulee näytteeseen
I: Valo poistuu näytteestä
C: Näytteen pitoisuus
L: Valon reitti/näytteen paksuus
Ɛ: Ekstinktiokerroin

Pohjimmiltaan fotometri koostuu valonlähteestä, asennosta, jossa näyte pitää, ja ilmaisimesta (kuva 1). Ilmaisin mittaa näytteen läpi kulkevan valon voimakkuutta. Luonnollisesti mukana on useita muita komponentteja; erityisesti optiset elementit, jotka taittavat valon ja erottavat sen yksittäisiksi aallonpituuksiksi sekä elementit, jotka heijastavat tai lähettävät valoa.

Fotometrin valonlähde lähettää määrätyllä intensiteetillä I ₀ valoa, joka ohjataan näyteliuoksen läpi. Näyte absorboi osan valosta. Ilmaisin rekisteröi osan, joka kulkee näytteen läpi, intensiteetiksi I. Suhde I/I ₀ kuvaa näytteen läpäisyä määrätyllä aallonpituudella.

Absorbanssin laskeminen (A = log (I ₀ /I)

Nykyaikaiset fotometrit muuttavat automaattisesti näytteen läpäisyn absorbanssiksi, joka määritellään läpäisyn negatiiviseksi dekadiseksi logaritmiksi. Herää kysymys, miksi lähetystä ei käytetä suoraan näytepitoisuuden laskemiseen. Kuva 2 selventää transmission ja absorbanssin välistä yhteyttä. Jos useita näytteitä, joista kukin sallii kulkea 50 % näytteeseen tulevasta valosta, kytketään sarjaan, tuloksena on eksponentiaalisesti laskeva lähetyskäyrä, joka on kuvattu alla. Jos arvot ilmaistaan sen sijaan logaritmisella tavalla, tuloksena on lineaarinen riippuvuus. Tällä tavalla absorbanssi on verrannollinen pitoisuuteen (sekä polun pituuteen), mikä yksinkertaistaa laskelmia huomattavasti.

Kuva 2: Valon läpäisyn ja absorbanssin välinen yhteys:

a) Näytteiden kytkeminen sarjaan, joista jokainen mahdollistaa 50 % näytteeseen tulevan valon läpäisyn. Prosenttiosuus koskee alkuperäistä valon voimakkuutta.

b) Eksponentiaalisesti laskeva lähetyskäyrä

c) Absorbanssin graafinen esitys (käyttäen lähetyksen dekadista logaritmia)

Pitoisuuden laskeminen (C = A/(L x Ɛ))

Näytteen pitoisuuden johtamiseksi sen absorbanssista tarvitaan lisätietoja. Lambert-Beerin laki, joka muodostaa fotometristen sovellusten fyysisen perustan, kuvaa, että näytteen valon absorptio on suoraan verrannollinen sen pitoisuuteen ja sen polun pituuteen. Kaiken kaikkiaan kolme parametria vaikuttavat näytteen absorbanssiarvoon: ensinnäkin molekyylin pitoisuus (C); toiseksi näytteen polun pituus (L), joka yleensä on sama kuin kyvetin polun pituus. Sitten on ekstinktiokerroin (Ɛ). Ekstinktiokerroin on molekyylille ainutlaatuinen fysikaalinen vakio; se kuvaa sen ominaisuutta absorboida valoa tietyllä aallonpituudella. Tämä materiaalispesifinen vakio tunnetaan useille aineille, mukaan lukien nukleiinihapot ja erilaiset proteiinit, ja arvot on julkaistu asiaa koskevassa kirjallisuudessa. Näissä tapauksissa pitoisuus voidaan määrittää välittömästi. Jos arvoa ei kuitenkaan tunneta, on mahdollista käyttää avuksi kalibrointikäyrää. Kalibrointikäyrän muodostamiseksi tarvitaan standardeja, eli liuoksia, jotka sisältävät tunnetut pitoisuudet analysoitavia aineita. Nämä mitataan fotometrillä ennen varsinaista näytettä. Analyytin pitoisuus lasketaan sitten käyttämällä standardikäyrää.

Kvantifioinnin lisäksi absorbanssimittaukset voivat paljastaa myös kvalitatiivista tietoa näytteestä: esimerkiksi nukleiinihappojen ja proteiinien puhtaus voidaan määrittää mittaamalla näyte ylimääräisillä aallonpituuksilla, kun taas entsyymiaktiivisuustiedot saadaan yleensä toistuvina mittauksina. aika.

Lähde