Bei molekularen und biochemischen Anwendungen sowie in der medizinischen Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentrationen von Substanzen in Lösung ein entscheidender Analyseschritt. Häufig werden hierfür photometrische Methoden eingesetzt, da diese einfach und schnell durchführbar sind und oft die kostengünstigste Option darstellen.

Im Allgemeinen beruhen (spektro-)photometrische Verfahren auf dem Prinzip, dass Moleküle in Lösung Licht absorbieren und das dadurch abgeschwächte Licht mit Hilfe eines Detektors gemessen wird. Wie der Name schon sagt, verwenden UV/Vis-Spektralphotometer sichtbares und ultraviolettes Licht im Wellenlängenbereich zwischen etwa 200 und 900 nm.

Um die Konzentration eines Analyten zu bestimmen, wird meistens die Wellenlänge verwendet, bei der das Molekül die höchste Extinktion (Spitzenwellenlänge) aufweist. Bei Nukleinsäuren und Proteinen wären dies beispielsweise 260 nm bzw. 280 nm. Die durch das Lambert-Beer-Gesetz beschriebenen physikalischen Gesetze bilden die Grundlage für die Berechnung der Konzentration eines Stoffes aus photometrischen Messungen. Dies geschieht nach den Schritten der unten aufgeführten Formeln:

1. Transmission oder Transmission (T) = I/I ₀
   Die Transmission wird in einem Photometer bestimmt, indem das Verhältnis zwischen dem austretenden und dem in die Probe eintretenden Licht verwendet wird.
2. Extinktion (A) = log (I ₀ /I)
   Die Extinktion wird aus dem negativen dekadischen Logarithmus der Transmission berechnet.
3. Extinktion (A) = C x L x Ɛ => Konzentration (C) = A/(L x Ɛ)
   Das Lambert-Beer-Gesetz beschreibt die Abhängigkeit der Extinktion von der Konzentration der Probe (C), der optischen Weglänge (L) sowie die Abhängigkeit von einem probenspezifischen Extinktionskoeffizienten (Ɛ), der zu einer bestimmten Substanz gehört bei einer bestimmten Wellenlänge. Die Probenkonzentration wird dann durch Umrechnung der Formel berechnet.

Diese drei Aussagen werden im Folgenden näher beschrieben.

Transmissionsbestimmung (T = I/I ₀ )

Abbildung 1: Vereinfachter Aufbau eines Photometers mit Darstellung der Probe und Parameter, die für das Lambert-Beer-Gesetz relevant sind

I ₀ : Licht, das in die Probe eindringt
I: Licht, das die Probe verlässt
C: Konzentration der Probe
L: Lichtweg/Dicke der Probe
Ɛ: Extinktionskoeffizient

Grundsätzlich besteht ein Photometer aus einer Lichtquelle, einer Position, die die Probe hält, und einem Detektor (Abbildung 1). Der Detektor misst die Intensität des Lichts, das durch die Probe wandert. Natürlich sind eine Reihe anderer Komponenten vorhanden; insbesondere optische Elemente, die das Licht brechen und in einzelne Wellenlängen zerlegen sowie Elemente, die das Licht reflektieren oder durchlassen.

Die Lichtquelle eines Photometers sendet Licht mit definierter Intensität I ₀ aus, das durch die Probenlösung geleitet wird. Ein Teil des Lichts wird von der Probe absorbiert. Der Anteil, der die Probe durchdringt, wird vom Detektor als Intensität I registriert. Das Verhältnis I/I ₀ beschreibt die Transmission der Probe bei einer definierten Wellenlänge.

Berechnung der Extinktion (A = log (I ₀ /I)

Moderne Photometer wandeln die Transmission einer Probe automatisch in Extinktion um, die als negativer dekadischer Logarithmus der Transmission definiert ist. Es stellt sich die Frage, warum die Transmission nicht direkt zur Berechnung der Probenkonzentration herangezogen wird. Abbildung 2 verdeutlicht den Zusammenhang zwischen Transmission und Absorption. Werden mehrere Proben, die jeweils 50 % des einfallenden Lichts passieren lassen, hintereinander geschaltet, ergibt sich die unten abgebildete, exponentiell abfallende Transmissionskurve. Wenn die Werte stattdessen logarithmisch ausgedrückt werden, ergibt sich eine lineare Abhängigkeit. Auf diese Weise ist die Extinktion proportional zur Konzentration (sowie zur Weglänge), was die Berechnungen erheblich vereinfacht.

Abbildung 2: Der Zusammenhang zwischen Transmission und Absorption von Licht:

a) Hintereinanderschalten von Proben, die jeweils 50 % des in die Probe einfallenden Lichts durchlassen. Der Prozentsatz bezieht sich auf die anfängliche Lichtintensität.

b) Exponentiell abfallende Transmissionskurve

c) Grafische Darstellung der Extinktion (unter Verwendung des dekadischen Logarithmus der Transmission)

Konzentrationsberechnung (C = A/(L x Ɛ))

Um die Konzentration einer Probe aus ihrer Extinktion abzuleiten, sind zusätzliche Informationen erforderlich. Das Lambert-Beer-Gesetz, das die physikalische Grundlage für photometrische Anwendungen bildet, beschreibt, dass die Absorption von Licht durch eine Probe direkt proportional zu ihrer Konzentration und ihrer Weglänge ist. Insgesamt tragen drei Parameter zum Extinktionswert einer Probe bei: erstens die Konzentration (C) des Moleküls; Zweitens die Weglänge (L) der Probe, die im Allgemeinen gleich der Weglänge der Küvette ist. Dann gibt es noch den Extinktionskoeffizienten (Ɛ). Der Extinktionskoeffizient ist eine für das Molekül einzigartige physikalische Konstante; es beschreibt seine Eigenschaft, Licht bei einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Diese materialspezifische Konstante ist für eine Reihe von Substanzen, darunter Nukleinsäuren und verschiedene Proteine, bekannt und die Werte in der einschlägigen Literatur veröffentlicht. In diesen Fällen kann die Konzentration sofort bestimmt werden. Ist der Wert jedoch nicht bekannt, kann eine Kalibrierkurve zu Hilfe genommen werden. Zur Erstellung einer Kalibrierkurve werden Standards benötigt, dh Lösungen, die bekannte Konzentrationen der zu analysierenden Substanzen enthalten. Diese werden im Photometer vor der eigentlichen Probe gemessen. Die Konzentration des Analyten wird dann unter Verwendung der Standardkurve berechnet.

Neben der Quantifizierung können Extinktionsmessungen auch qualitative Informationen über die Probe liefern: Beispielsweise kann die Reinheit von Nukleinsäuren und Proteinen bestimmt werden, indem die Probe Messungen bei zusätzlichen Wellenlängen unterzogen wird, während Informationen über die Enzymaktivität im Allgemeinen durch wiederholte Messungen gewonnen werden Zeit.

Quelle