Dentro de las aplicaciones moleculares y bioquímicas, así como en el diagnóstico médico, la determinación de las concentraciones de sustancias en solución es un paso crucial del análisis. Con frecuencia, los métodos fotométricos se emplean para este propósito, ya que estos se pueden realizar de manera fácil y rápida, y porque a menudo representan la opción más rentable.

En general, los métodos (espectro)fotométricos se basan en el principio de que las moléculas en solución absorben la luz y que la luz así debilitada se mide con la ayuda de un detector. Como implica el nombre, los espectrofotómetros UV/Vis utilizan luz visible y ultravioleta en el rango de longitud de onda entre aproximadamente 200 y 900 nm.

Para determinar la concentración de un analito, la mayoría de las veces se utiliza la longitud de onda en la que la molécula muestra la absorbancia más alta (longitud de onda máxima). En el caso de los ácidos nucleicos y las proteínas, por ejemplo, serían 260 nm y 280 nm, respectivamente. Las leyes de la física descritas por la ley de Lambert-Beer forman la base para el cálculo de la concentración de una sustancia a partir de mediciones fotométricas. Esto ocurre de acuerdo con los pasos de las fórmulas que se enumeran a continuación:

1. Transmisión o transmitancia (T) = I/I ₀
   La transmisión se determina en un fotómetro, utilizando la relación entre la luz que sale y la luz que entra en la muestra.
2. Absorbancia (A) = log (I ₀ /I)
   La absorbancia se calcula a partir del logaritmo decádico negativo de transmisión.
3. Absorbancia (A) = C x L x Ɛ => Concentración (C) = A/(L x Ɛ)
   La ley de Lambert-Beer describe la dependencia de la absorbancia de la concentración de la muestra (C), la longitud del camino óptico (L), así como la dependencia del coeficiente de extinción específico de la muestra (Ɛ), que pertenece a una sustancia específica. en una longitud de onda específica. Luego se calcula la concentración de la muestra convirtiendo la fórmula.

Estas tres declaraciones se describen con más detalle a continuación.

Determinación de la transmisión (T = I/I ₀ )

Figura 1: Montaje simplificado de un fotómetro que representa la muestra y los parámetros que son relevantes para la ley de Lambert-Beer

I ₀ : Luz que entra en la muestra
I: Luz que sale de la muestra
C: Concentración de la muestra
L: Paso de luz/grosor de la muestra
Ɛ: Coeficiente de extinción

Básicamente, un fotómetro consta de una fuente de luz, una posición que sostiene la muestra y un detector (figura 1). El detector mide la intensidad de la luz que viaja a través de la muestra. Naturalmente, están presentes varios otros componentes; específicamente, elementos ópticos que refractan la luz y la separan en longitudes de onda individuales así como elementos que reflejan o transmiten la luz.

La fuente de luz de un fotómetro emite luz con una intensidad I ₀ definida, que es guiada a través de la solución de muestra. Una parte de la luz será absorbida por la muestra. La porción que atraviesa la muestra es registrada por el detector como intensidad I. La relación I/I ₀ describe la transmisión de la muestra a una longitud de onda definida.

Cálculo de la absorbancia (A = log (I ₀ /I)

Los fotómetros modernos convierten automáticamente la transmisión de una muestra en absorbancia, que se define como el logaritmo decádico negativo de transmisión. Surge la pregunta de por qué la transmisión no se utiliza directamente para el cálculo de la concentración de la muestra. La Figura 2 aclara la conexión entre transmisión y absorbancia. Si se conectan en serie varias muestras, cada una de las cuales permite el paso del 50 % de la luz que entra en la muestra, se obtendrá la curva de transmisión exponencialmente decreciente, que se muestra a continuación. Si, en cambio, los valores se expresan de forma logarítmica, se producirá una dependencia lineal. De esta forma, la absorbancia es proporcional a la concentración (así como a la longitud del camino), lo que simplifica considerablemente los cálculos.

Figura 2: La conexión entre la transmisión y la absorbancia de la luz:

a) Conexión de muestras en serie, cada una de las cuales permita la transmisión del 50 % de la luz que ingresa a la muestra. El porcentaje se refiere a la intensidad de luz inicial.

b) Curva de transmisión exponencialmente decreciente

c) Representación gráfica de la absorbancia (utilizando el logaritmo decádico de transmisión)

Cálculo de la concentración (C = A/(L x Ɛ))

Para derivar la concentración de una muestra a partir de su absorbancia, se requiere información adicional. La ley de Lambert-Beer, que constituye la base física de las aplicaciones fotométricas, describe que la absorción de luz por parte de una muestra es directamente proporcional a su concentración y la longitud de su trayectoria. En total, tres parámetros contribuyen al valor de absorbancia de una muestra: primero, la concentración (C) de la molécula; segundo, la longitud del camino (L) de la muestra, que generalmente es igual a la longitud del camino de la cubeta. Luego está el coeficiente de extinción (Ɛ). El coeficiente de extinción es una constante física exclusiva de la molécula; describe su propiedad de absorber luz en una longitud de onda específica. Esta constante específica del material se conoce para varias sustancias, incluidos los ácidos nucleicos y varias proteínas, y los valores se han publicado en la literatura pertinente. En estos casos, la concentración se puede determinar instantáneamente. Sin embargo, si no se conoce el valor, es posible obtener la ayuda de una curva de calibración. Para generar una curva de calibración, se requieren estándares, es decir, soluciones que contengan concentraciones conocidas de las sustancias a analizar. Estos se miden en el fotómetro antes de la muestra real. Luego se calcula la concentración del analito usando la curva estándar.

Además de la cuantificación, las mediciones de absorbancia también pueden revelar información cualitativa sobre la muestra: por ejemplo, la pureza de los ácidos nucleicos y las proteínas se puede determinar sometiendo la muestra a mediciones en longitudes de onda adicionales, mientras que la información sobre la actividad enzimática generalmente se obtiene a través de mediciones repetidas durante hora.

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