För fotometriska analyser av vätskeprover måste lösningen placeras i ljusbanan på en fotometer i ett definierat format. Kyvetter, dvs provbehållare med optiska fönster, är standardvalet för denna applikation.

Bildkälla: science photo/shutterstock.com

För fotometriska analyser av vätskeprover måste lösningen placeras i ljusbanan på en fotometer i ett definierat format. Kyvetter, dvs provbehållare med optiska fönster, är standardvalet för denna applikation. Avståndet mellan de optiska fönstren är noggrant definierat; på detta sätt är väglängden för provet inuti kyvetten känd. Urvalet av olika typer av kyvetter är stort – även om man bara tar hänsyn till de kyvetter som används för absorbansmätningar inom området UV-Vis-spektroskopi. Den vanligaste typen av kyvett är fyrkantig, med yttermått på 12,5 x 12,5 mm. Detta format rymmer provvolymer från mikroliterintervallet (ultramikrokyvetter) till milliliterintervallet (makrokyvetter) (figur 1). Standardväglängden för en kyvett mäter 10 mm; dock finns även kyvetter som ger en kortare ljusväg genom provet. Dessutom skiljer sig kyvetter med avseende på sitt material, sin höjd och storleken på sitt mätfönster (figur 1).

Figur 1: Kyvetter som har standardyttre dimensioner på 12,5 x 12,5 mm men som kräver olika minimiprovvolymer.

Kolla vår lista över kvartskyvetter för UV/Vis/IR-spektroskopi

Beslutet om vilken typ av kyvett som ska väljas beror på det instrument som används, på applikationens karaktär och på provets egenskaper. Det är generellt viktigt att kyvetter är så transparenta som möjligt för våglängderna som ska mätas för att inte begränsa fotometerns tillgängliga linjära intervall.

Valet av utrustning kräver krav på kyvetten eftersom den måste vara kompatibel med anordningen. Detta gäller främst kyvettens yttermått då den behöver passa in i kyvettskaftet, men även höjden på mätfönstren är avgörande. Dessa måste passa perfekt med ljusbanan som färdas genom instrumentet. Detta övervägande är särskilt relevant för kyvetter som är designade för att mäta små volymer och som därför har mycket små mätfönster. Vanliga höjder på ljusvägar är 8,5 mm och 15 mm.

Nästa viktiga aspekt gäller de mätvåglängder som är involverade i den aktuella applikationen. Standardkyvetter av PMMA, polystyren eller vanligt glas är endast genomskinliga i det synliga området. Om våglängder i UV-området, under cirka 300 nm, används, måste kyvetter av kvartsglas eller en speciell plasttyp som ger tillräcklig transparens i detta intervall användas (figur 2).

Figur 2: Skillnader mellan absorbansspektra för kyvetter gjorda av olika material, mätt mellan 220 nm och 400 nm

Uppvärmning och effektiv temperaturkontroll av ett prov under mätningsprocessen är avgörande för de metoder som bygger på reaktioner som sker vid en viss specifik temperatur och som mäter absorbans över tid. Förutom en lämplig motståndsnivå hos materialet är det i detta fall viktigt att kontaktytan mellan kyvettväggen och det temperaturkontrollerade kyvettskaftet är så stort som möjligt. Av dessa skäl ger vissa kyvetter, såsom makrokyvetter, en fördel i temperaturkontrollerade applikationer.

Andra aspekter som kommer att påverka valet av kyvett inkluderar arten, volymen och koncentrationen av provet.
Om provet är baserat på en vattenlösning är materialet som kyvetten är gjord av relativt oviktigt. Om däremot organiska lösningsmedel är inblandade är glaskyvetter det föredragna valet då dessa uppvisar högre motståndskraft jämfört med varianter av plast.

Om endast en liten mängd prov är tillgänglig kan man överväga att återanvända provet för följande mätningar. I detta fall rekommenderas engångsplastkyvetter. Plastkyvetter, om de är individuellt förpackade och av lämplig renhetsgrad, kommer att minimera risken för kontaminering. Alternativt kan kyvetter väljas som utformats för att rymma extremt små volymer.

Koncentrationen av ett prov kommer också att påverka valet av kyvett eftersom varje instrument har en övre detektionsgräns. Om man till exempel använder en fotometer med ett linjärt mätområde på upp till 2 A med en väglängd på 10 mm, kan dubbelsträngat DNA kvantifieras tillförlitligt upp till en maximal koncentration på 100 µg/ml. Lösningar med högre koncentrationer måste antingen spädas ut eller så kan spädningen simuleras med en kyvett som har en kortare väglängd. Enligt Lambert-Beer-lagen tillåter således en väglängd på 1 mm mätning av dsDNA-koncentrationer så höga som 1 000 µg/ml.

Om det inte föreskrivs av applikationens natur, presenterar kyvettens material ett ytterligare val som måste göras. I allmänhet visar glaskyvetter större transparens och mätnoggrannhet, och de kan återanvändas många gånger. Återigen är hanteringen av plastkyvetter enkel och säker. Eftersom plastkyvetter endast används en gång och inte kräver rengöring behöver man inte ta hänsyn till eventuella skador och förluster.

Källa