W celu analizy fotometrycznej próbek ciekłych roztwór należy umieścić na drodze światła fotometru w określonym formacie. Kuwety, czyli pojemniki na próbki z okienkami optycznymi, są standardowym wyborem do tej aplikacji.

Źródło obrazu: Science photo/shutterstock.com

W celu analizy fotometrycznej próbek ciekłych roztwór należy umieścić na drodze światła fotometru w określonym formacie. Kuwety, czyli pojemniki na próbki z okienkami optycznymi, są standardowym wyborem do tej aplikacji. Odległość między oknami optycznymi jest dokładnie określona; w ten sposób znana jest długość drogi próbki wewnątrz kuwety. Wybór różnych typów kuwet jest ogromny – nawet jeśli brane są pod uwagę tylko te kuwety, które są używane do pomiarów absorbancji w obszarze spektroskopii UV-Vis. Najpopularniejszym typem kuwety są kuwety kwadratowe o wymiarach zewnętrznych 12,5 x 12,5 mm. Ten format obejmuje próbki o objętości od mikrolitrów (kuwety ultra-mikro) do mililitrów (kuwety makro) (rysunek 1). Standardowa długość ścieżki kuwety wynosi 10 mm; dostępne są jednak również kuwety, które zapewniają krótszą drogę światła przez próbkę. Ponadto kuwety różnią się materiałem, wysokością i rozmiarem okienka pomiarowego (rysunek 1).

Rysunek 1: Kuwety o standardowych wymiarach zewnętrznych 12,5 x 12,5 mm, które wymagają różnych minimalnych objętości próbek.

Sprawdź naszą listę kuwet kwarcowych do spektroskopii UV/Vis/IR

Decyzja o wyborze typu kuwety będzie zależeć od użytego przyrządu, charakteru aplikacji i właściwości próbki. Zasadniczo ważne jest, aby kuwety były jak najbardziej przezroczyste dla mierzonych długości fal, aby nie ograniczać dostępnego liniowego zakresu fotometru.

Dobór sprzętu wymaga spełnienia wymagań co do kuwety, ponieważ musi być ona kompatybilna z urządzeniem. Dotyczy to głównie zewnętrznych wymiarów kuwety, ponieważ musi ona zmieścić się w trzonie kuwety, ale ważna jest również wysokość okien pomiarowych. Muszą one idealnie współgrać ze ścieżką światła przechodzącą przez instrument. Ta uwaga jest szczególnie istotna w przypadku kuwet zaprojektowanych do pomiaru małych objętości, a zatem charakteryzujących się bardzo małymi oknami pomiarowymi. Typowe wysokości ścieżek świetlnych to 8,5 mm i 15 mm.

Kolejny ważny aspekt dotyczy długości fal pomiarowych, które są zaangażowane w daną aplikację. Standardowe kuwety wykonane z PMMA, polistyrenu lub zwykłego szkła są przezroczyste tylko w widocznym zakresie. Jeżeli stosuje się długości fal w zakresie UV, poniżej około 300 nm, należy użyć kuwet wykonanych ze szkła kwarcowego lub specjalnego rodzaju tworzywa sztucznego, które zapewniają wystarczającą przezroczystość w tym zakresie (rysunek 2).

Rysunek 2: Różnice między widmami absorbancji kuwet wykonanych z różnych materiałów, mierzone między 220 nm a 400 nm

Ogrzewanie i skuteczna kontrola temperatury próbki podczas procesu pomiarowego ma kluczowe znaczenie dla tych metod, które opierają się na reakcjach zachodzących w określonej temperaturze i mierzą absorbancję w czasie. Oprócz odpowiedniego poziomu odporności materiału, ważne jest w tym przypadku, aby powierzchnia styku między ścianką kuwety a trzonem kuwety z kontrolowaną temperaturą była jak największa. Z tych powodów niektóre kuwety, takie jak makro-kuwety, mają przewagę w zastosowaniach z kontrolowaną temperaturą.

Inne aspekty, które będą miały wpływ na wybór kuwety, to rodzaj, objętość i stężenie próbki pod ręką.
Jeżeli próbka jest oparta na roztworze wodnym, materiał, z którego wykonana jest kuweta, jest stosunkowo nieistotny. Z drugiej strony, jeśli w grę wchodzą rozpuszczalniki organiczne, preferowanym wyborem są kuwety szklane, ponieważ wykazują one wyższą odporność w porównaniu z wariantami wykonanymi z tworzywa sztucznego.

Jeśli dostępna jest tylko niewielka ilość próbki, można rozważyć ponowne użycie próbki do kolejnych pomiarów. W takim przypadku zalecane są jednorazowe kuwety plastikowe. Kuwety plastikowe, jeśli są pakowane pojedynczo i mają odpowiedni stopień czystości, zminimalizują ryzyko zanieczyszczenia. Alternatywnie można wybrać kuwety, które zostały zaprojektowane tak, aby pomieścić wyjątkowo małe objętości.

Stężenie próbki również będzie miało wpływ na wybór kuwety, ponieważ każdy przyrząd ma górną granicę wykrywalności. Na przykład, jeśli używa się fotometru o liniowym zakresie pomiarowym do 2 A z długością ścieżki 10 mm, dwuniciowe DNA można wiarygodnie określić ilościowo do maksymalnego stężenia 100 µg/ml. Roztwory o wyższych stężeniach należy albo rozcieńczyć, albo rozcieńczenie można symulować za pomocą kuwety o krótszej drodze. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera, długość ścieżki 1 mm umożliwia zatem pomiar stężeń dsDNA aż do 1000 µg/mL.

Jeśli nie wynika to z charakteru aplikacji, materiał kuwety stanowi kolejny wybór do dokonania. Generalnie kuwety szklane charakteryzują się większą przejrzystością i dokładnością pomiaru i mogą być wielokrotnie używane. Z drugiej strony obsługa plastikowych kuwet jest prosta i bezpieczna. Ponieważ plastikowe kuwety są używane tylko raz i nie wymagają czyszczenia, nie trzeba brać pod uwagę ewentualnych uszkodzeń i strat.

Źródło