Voor fotometrische analyses van vloeistofmonsters moet de oplossing in een gedefinieerd formaat in het lichtpad van een fotometer worden geplaatst. Cuvetten, dwz monstercontainers met optische vensters, zijn de standaardkeuze voor deze toepassing.

Afbeeldingsbron: science photo/shutterstock.com

Voor fotometrische analyses van vloeistofmonsters moet de oplossing in een gedefinieerd formaat in het lichtpad van een fotometer worden geplaatst. Cuvetten, dwz monstercontainers met optische vensters, zijn de standaardkeuze voor deze toepassing. De afstand tussen de optische vensters is nauwkeurig gedefinieerd; op deze manier is de padlengte van het monster in de cuvet bekend. De keuze aan verschillende soorten kuvetten is enorm – zelfs als alleen die kuvetten worden overwogen die worden gebruikt voor absorptiemetingen op het gebied van UV-Vis-spectroscopie. Het meest voorkomende type kuvet is vierkant, met uitwendige afmetingen van 12,5 x 12,5 mm. Dit formaat is geschikt voor monstervolumes van het microliterbereik (ultramicrocuvetten) tot het milliliterbereik (macrocuvetten) (figuur 1). De standaard padlengte van een kuvet is 10 mm; er zijn echter ook cuvetten beschikbaar die zorgen voor een kortere lichtweg door het monster. Daarnaast verschillen cuvetten door hun materiaal, hun hoogte en de grootte van hun meetvenster (figuur 1).

Figuur 1: Cuvetten met de standaard buitenafmetingen van 12,5 x 12,5 mm, maar die verschillende minimale monstervolumes vereisen.

Bekijk onze lijst met kwartscuvetten voor UV/Vis/IR-spectroscopie

De beslissing over het te kiezen type cuvet hangt af van het gebruikte instrument, de aard van de toepassing en de eigenschappen van het monster. Het is over het algemeen belangrijk dat cuvetten zo transparant mogelijk zijn voor de te meten golflengten, zodat het beschikbare lineaire bereik van de fotometer niet wordt beperkt.

De keuze van de apparatuur stelt eisen aan de cuvet, aangezien deze compatibel moet zijn met het apparaat. Dit heeft vooral betrekking op de buitenafmetingen van de kuvet, aangezien deze in de kuvettenschacht moet passen, maar ook de hoogte van de meetvensters is cruciaal. Deze moeten perfect aansluiten op het lichtpad dat door het instrument loopt. Deze overweging is met name relevant voor cuvetten die zijn ontworpen om kleine volumes te meten en die daarom zeer kleine meetvensters hebben. Gangbare hoogtes van lichtpaden zijn 8,5 mm en 15 mm.

Het volgende belangrijke aspect betreft de meetgolflengten die betrokken zijn bij de betreffende toepassing. Standaard kuvetten van PMMA, polystyreen of normaal glas zijn alleen transparant in het zichtbare bereik. Als golflengten in het UV-bereik, beneden circa 300 nm, worden gebruikt, moeten cuvetten van kwartsglas of een speciaal soort kunststof worden gebruikt, die in dit bereik voldoende transparantie bieden (figuur 2).

Figuur 2: Verschillen tussen de absorptiespectra van cuvetten gemaakt van verschillende materialen, gemeten tussen 220 nm en 400 nm

Verwarming en efficiënte temperatuurregeling van een monster tijdens het meetproces is cruciaal voor die methoden die afhankelijk zijn van reacties die plaatsvinden bij een bepaalde specifieke temperatuur en die de absorptie in de loop van de tijd meten. Naast een passende weerstand van het materiaal is het daarbij van belang dat het contactoppervlak tussen de wand van de kuvet en de temperatuurgeregelde kuvettenschacht zo groot mogelijk is. Om deze redenen bieden bepaalde cuvetten, zoals macro-cuvetten, een voordeel bij temperatuurgecontroleerde toepassingen.

Andere aspecten die van invloed zijn op de keuze van de cuvet zijn de aard, het volume en de concentratie van het aanwezige monster.
Als het monster is gebaseerd op een waterige oplossing, is het materiaal waaruit de cuvet is gemaakt relatief onbelangrijk. Als het daarentegen organische oplosmiddelen betreft, hebben glazen cuvetten de voorkeur, omdat deze een hogere weerstand hebben in vergelijking met varianten van kunststof.

Als er slechts een kleine hoeveelheid monster beschikbaar is, kan worden overwogen om het monster opnieuw te gebruiken voor volgende metingen. In dit geval worden plastic cuvetten voor eenmalig gebruik aanbevolen. Kunststof cuvetten, indien afzonderlijk verpakt en van een geschikte zuiverheidsgraad, zullen het risico op besmetting minimaliseren. Als alternatief kunnen cuvetten worden gekozen die zijn ontworpen voor extreem kleine volumes.

Ook de concentratie van een monster is van invloed op de keuze van de cuvet, aangezien elk instrument een bovengrens van detectie heeft. Bij gebruik van bijvoorbeeld een fotometer met een lineair meetbereik tot 2 A en een padlengte van 10 mm, kan dubbelstrengs DNA betrouwbaar worden gekwantificeerd tot een maximale concentratie van 100 µg/ml. Oplossingen met hogere concentraties moeten ofwel worden verdund, of de verdunning kan worden gesimuleerd met een cuvet met een kortere padlengte. Volgens de wet van Lambert-Beer maakt een padlengte van 1 mm het dus mogelijk om dsDNA-concentraties tot 1.000 µg/ml te meten.

Indien door de aard van de toepassing niet voorgeschreven, vormt het materiaal van de kuvet een nadere keuze. Over het algemeen hebben glazen cuvetten een grotere transparantie en meetnauwkeurigheid, en kunnen ze vele malen worden hergebruikt. Aan de andere kant is het hanteren van plastic cuvetten eenvoudig en veilig. Omdat kunststof kuvetten slechts eenmalig worden gebruikt en niet hoeven te worden gereinigd, hoeft geen rekening te worden gehouden met eventuele schade en verlies.

Bron