Zur photometrischen Analyse flüssiger Proben muss die Lösung in einem definierten Format in den Strahlengang eines Photometers gebracht werden. Küvetten, also Probengefäße mit optischen Fenstern, sind die Standardauswahl für diese Anwendung.

Bildquelle: science photo/shutterstock.com

Zur photometrischen Analyse flüssiger Proben muss die Lösung in einem definierten Format in den Strahlengang eines Photometers gebracht werden. Küvetten, also Probengefäße mit optischen Fenstern, sind die Standardauswahl für diese Anwendung. Der Abstand zwischen den optischen Fenstern ist genau definiert; Auf diese Weise ist die Weglänge der Probe in der Küvette bekannt. Die Auswahl an unterschiedlichen Küvettentypen ist groß – auch wenn nur die Küvetten betrachtet werden, die für Extinktionsmessungen im Bereich der UV-Vis-Spektroskopie verwendet werden. Der gebräuchlichste Küvettentyp ist quadratisch mit Außenabmessungen von 12,5 x 12,5 mm. Dieses Format bietet Platz für Probenvolumina vom Mikroliterbereich (Ultramikroküvetten) bis zum Milliliterbereich (Makroküvetten) (Abbildung 1). Die Standardschichtdicke einer Küvette beträgt 10 mm; Es sind jedoch auch Küvetten erhältlich, die einen kürzeren Lichtweg durch die Probe bieten. Darüber hinaus unterscheiden sich Küvetten hinsichtlich ihres Materials, ihrer Höhe und der Größe ihres Messfensters (Abbildung 1).

Abbildung 1: Küvetten mit den Standardaußenmaßen von 12,5 x 12,5 mm, die aber unterschiedliche Mindestprobenvolumina benötigen.

Sehen Sie sich unsere Liste der Quarzküvetten für die UV/Vis/IR-Spektroskopie an

Die Entscheidung, welcher Küvettentyp zu wählen ist, hängt vom verwendeten Gerät, von der Art der Anwendung und von den Eigenschaften der Probe ab. Generell ist es wichtig, dass Küvetten für die zu messenden Wellenlängen möglichst transparent sind, um den verfügbaren linearen Bereich des Photometers nicht einzuschränken.

Die Auswahl der Ausrüstung stellt Anforderungen an die Küvette, da diese mit dem Gerät kompatibel sein muss. Dies betrifft vor allem die Außenmaße der Küvette, da diese in den Küvettenschacht passen muss, aber auch die Höhe der Messfenster ist entscheidend. Diese müssen perfekt auf den Lichtweg ausgerichtet sein, der durch das Instrument verläuft. Diese Überlegung ist besonders relevant für Küvetten, die für die Messung kleiner Volumina ausgelegt sind und daher sehr kleine Messfenster aufweisen. Gängige Lichtweghöhen sind 8,5 mm und 15 mm.

Der nächste wichtige Aspekt betrifft die Messwellenlängen, die in der jeweiligen Anwendung involviert sind. Standardküvetten aus PMMA, Polystyrol oder Normalglas sind nur im sichtbaren Bereich transparent. Bei Wellenlängen im UV-Bereich unterhalb von ca. 300 nm müssen Küvetten aus Quarzglas oder einem speziellen Kunststoff verwendet werden, die in diesem Bereich eine ausreichende Transparenz bieten (Abbildung 2).

Abbildung 2: Unterschiede zwischen den Absorptionsspektren von Küvetten aus verschiedenen Materialien, gemessen zwischen 220 nm und 400 nm

Die Erwärmung und effiziente Temperaturkontrolle einer Probe während des Messvorgangs ist entscheidend für Methoden, die auf Reaktionen beruhen, die bei einer bestimmten spezifischen Temperatur stattfinden und die Absorption über die Zeit messen. Neben einer entsprechenden Beständigkeit des Materials ist es dabei wichtig, dass die Kontaktfläche zwischen der Küvettenwand und dem temperierten Küvettenschacht möglichst groß ist. Aus diesen Gründen bieten bestimmte Küvetten, wie z. B. Makroküvetten, einen Vorteil bei temperaturgesteuerten Anwendungen.

Weitere Aspekte, die die Wahl der Küvette beeinflussen, sind die Art, das Volumen und die Konzentration der vorliegenden Probe.
Basiert die Probe auf einer wässrigen Lösung, ist das Material, aus dem die Küvette besteht, relativ unerheblich. Handelt es sich dagegen um organische Lösungsmittel, sind Glasküvetten die bevorzugte Wahl, da diese gegenüber Varianten aus Kunststoff eine höhere Beständigkeit aufweisen.

Wenn nur eine kleine Probenmenge verfügbar ist, kann man erwägen, die Probe für nachfolgende Messungen wiederzuverwenden. In diesem Fall werden Einwegküvetten aus Kunststoff empfohlen. Kunststoffküvetten minimieren, wenn sie einzeln verpackt sind und einen angemessenen Reinheitsgrad aufweisen, das Kontaminationsrisiko. Alternativ können Küvetten ausgewählt werden, die für extrem kleine Volumina ausgelegt sind.

Auch die Konzentration einer Probe beeinflusst die Wahl der Küvette, da jedes Instrument eine obere Nachweisgrenze hat. Wird beispielsweise ein Photometer mit einem linearen Messbereich bis 2 A bei einer Schichtdicke von 10 mm verwendet, kann doppelsträngige DNA bis zu einer maximalen Konzentration von 100 µg/ml zuverlässig quantifiziert werden. Höher konzentrierte Lösungen müssen entweder verdünnt werden oder die Verdünnung kann mit einer Küvette mit kürzerer Schichtdicke simuliert werden. Nach dem Lambert-Beer-Gesetz erlaubt somit eine Schichtdicke von 1 mm die Messung von dsDNA-Konzentrationen von bis zu 1.000 µg/mL.

Wenn es die Art der Anwendung nicht vorschreibt, stellt das Material der Küvette eine weitere zu treffende Auswahl dar. Generell weisen Glasküvetten eine höhere Transparenz und Messgenauigkeit auf und sind vielfach wiederverwendbar. Andererseits ist die Handhabung von Kunststoffküvetten einfach und sicher. Da Kunststoffküvetten nur einmal verwendet werden und keiner Reinigung bedürfen, muss mit möglichen Beschädigungen und Verlusten nicht gerechnet werden.

Quelle