I synlig spektrofotometri kan absorptionen eller \u00f6verf\u00f6ringen av ett visst \u00e4mne best\u00e4mmas av den observerade f\u00e4rgen. Till exempel, ett l\u00f6sningsprov som absorberar ljus \u00f6ver alla synliga omr\u00e5den (dvs. s\u00e4nder ingen av synliga v\u00e5gl\u00e4ngder) verkar svart i teorin. \u00c5 andra sidan, om alla synliga v\u00e5gl\u00e4ngder s\u00e4nds ut (dvs. absorberar ingenting), ser l\u00f6sningsprovet vitt ut. Om ett l\u00f6sningsprov absorberar r\u00f6tt ljus (~700 nm) ser det gr\u00f6nt ut eftersom gr\u00f6nt \u00e4r komplementf\u00e4rgen till r\u00f6tt. Synliga spektrofotometrar anv\u00e4nder i praktiken ett prisma f\u00f6r att begr\u00e4nsa ett visst v\u00e5gl\u00e4ngdsomr\u00e5de (f\u00f6r att filtrera bort andra v\u00e5gl\u00e4ngder) s\u00e5 att den speciella ljusstr\u00e5len passerar genom ett l\u00f6sningsprov.<\/p>\n\n
Enheter och mekanism<\/h2>\n\n
Figur 1 illustrerar den grundl\u00e4ggande strukturen f\u00f6r spektrofotometrar. Den best\u00e5r av en ljusk\u00e4lla, en kollimator, en monokromator, en v\u00e5gl\u00e4ngdsv\u00e4ljare, en kyvett f\u00f6r provl\u00f6sning, en fotoelektrisk detektor och en digital display eller en m\u00e4tare. Detaljerad mekanism beskrivs nedan. Figur 2 visar en provspektrofotometer (modell: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>En spektrofotometer best\u00e5r i allm\u00e4nhet av tv\u00e5 enheter; en spektrometer och en fotometer. En spektrometer \u00e4r en enhet som producerar, vanligtvis sprider och m\u00e4ter ljus. En fotometer indikerar den fotoelektriska detektorn som m\u00e4ter ljusets intensitet.<\/p>\n\n
- Spektrometer<\/strong> : Den producerar ett \u00f6nskat v\u00e5gl\u00e4ngdsomr\u00e5de f\u00f6r ljus. F\u00f6rst s\u00e4nder en kollimator (lins) en rak ljusstr\u00e5le (fotoner) som passerar genom en monokromator (prisma) f\u00f6r att dela upp den i flera komponentv\u00e5gl\u00e4ngder (spektrum). Sedan s\u00e4nder en v\u00e5gl\u00e4ngdsv\u00e4ljare (slits) endast de \u00f6nskade v\u00e5gl\u00e4ngderna, som visas i figur 1.<\/li>
- Fotometer<\/strong> : Efter det \u00f6nskade v\u00e5gl\u00e4ngdsomr\u00e5det f\u00f6r ljuset passerar genom l\u00f6sningen av ett prov i kyvett, detekterar fotometern m\u00e4ngden fotoner som absorberas och skickar sedan en signal till en galvanometer eller en digital display, som illustreras i figur 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 2: En spektrofotometer med en enda v\u00e5gl\u00e4ngd<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Du beh\u00f6ver en spektrometer f\u00f6r att producera en m\u00e4ngd olika v\u00e5gl\u00e4ngder eftersom olika f\u00f6reningar absorberar b\u00e4st vid olika v\u00e5gl\u00e4ngder. Till exempel har p-nitrofenol (syraform) den maximala absorbansen vid cirka 320 nm och p-nitrofenolat (basform) absorberar b\u00e4st vid 400 nm, som visas i figur 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 3: Absorbans av tv\u00e5 olika f\u00f6reningar<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Om man tittar p\u00e5 grafen som m\u00e4ter absorbans och v\u00e5gl\u00e4ngd kan man ocks\u00e5 observera en isobestisk punkt. En isobestisk punkt<\/strong> \u00e4r den v\u00e5gl\u00e4ngd d\u00e4r absorbansen f\u00f6r tv\u00e5 eller flera arter \u00e4r densamma. Uppkomsten av en isosbestisk punkt i en reaktion visar att en mellanprodukt INTE kr\u00e4vs f\u00f6r att bilda en produkt fr\u00e5n en reaktant. Figur 4 visar ett exempel p\u00e5 en isobestisk punkt.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 4: Ett exempel p\u00e5 isosbestisk punkt (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Med h\u00e4nvisning tillbaka till figur 1 (och figur 5), \u00e4r m\u00e4ngden fotoner som g\u00e5r genom kyvetten och in i detektorn beroende p\u00e5 kyvettens l\u00e4ngd och koncentrationen av provet. N\u00e4r du v\u00e4l vet intensiteten av ljus efter att det passerat genom kyvetten kan du relatera det till transmittans (T). Transmittans \u00e4r den del av ljuset som passerar genom provet. Detta kan ber\u00e4knas med hj\u00e4lp av ekvationen:<\/p>\n\n
\\(Transmittans (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
D\u00e4r I t<\/sub> \u00e4r ljusintensiteten efter att ljusstr\u00e5len passerat genom kyvetten och I o<\/sub> \u00e4r ljusintensiteten innan ljusstr\u00e5len passerar genom kyvetten. Transmittans \u00e4r relaterad till absorption genom uttrycket:<\/p>\n\n
\\(Absorbans (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
D\u00e4r absorbans st\u00e5r f\u00f6r m\u00e4ngden fotoner som absorberas. Med m\u00e4ngden absorbans k\u00e4nd fr\u00e5n ovanst\u00e5ende ekvation, kan du best\u00e4mma den ok\u00e4nda koncentrationen av provet genom att anv\u00e4nda Beer-Lambert Law. Figur 5 illustrerar transmittans av ljus genom ett prov. L\u00e4ngden \\(l\\) anv\u00e4nds f\u00f6r Beer-Lambert Law som beskrivs nedan.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 5: Transmittans (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Beer-Lambert lag<\/h2>\n\n
Beer-Lambert Law<\/a> (\u00e4ven k\u00e4nd som Beer’s Law) s\u00e4ger att det finns ett linj\u00e4rt samband mellan absorbansen och koncentrationen av ett prov. Av denna anledning kan Beers lag endast<\/em> till\u00e4mpas n\u00e4r det finns ett linj\u00e4rt samband. Beers lag \u00e4r skrivet som:<\/p>\n\n
\\(A = \\epsilon{lc} \\)<\/p>\n\n
var<\/p>\n\n
- \\(A\\) \u00e4r m\u00e5ttet p\u00e5 absorbans (inga enheter),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) \u00e4r den mol\u00e4ra extinktionskoefficienten eller den mol\u00e4ra absorptionsf\u00f6rm\u00e5gan (eller absorptionskoefficienten),<\/li>
- \\(l\\) \u00e4r v\u00e4gl\u00e4ngden, och<\/li>
- \\(c\\) \u00e4r koncentrationen.<\/li><\/ul>\n
Den mol\u00e4ra extinktionskoefficienten anges som en konstant och varierar f\u00f6r varje molekyl. Eftersom absorbansen inte b\u00e4r n\u00e5gra enheter, m\u00e5ste enheterna f\u00f6r \\(\\epsilon\\) ta bort enheterna f\u00f6r l\u00e4ngd och koncentration. Som ett resultat har \\(\\epsilon\\) enheterna: L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . Banl\u00e4ngden m\u00e4ts i centimeter. Eftersom en standardspektrometer anv\u00e4nder en kyvett som \u00e4r 1 cm bred, antas \\(l\\) alltid vara lika med 1 cm. Eftersom absorption, \\(\\epsilon\\), och v\u00e4gl\u00e4ngd \u00e4r k\u00e4nda, kan vi ber\u00e4kna koncentrationen \\(c\\) av provet.<\/p>\n\n
Exempel 1<\/strong><\/p>\n\n
Guanosin<\/a> har en maximal absorbans p\u00e5 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) och banl\u00e4ngden \u00e4r 1 cm. Med hj\u00e4lp av en spektrofotometer hittar du det \\(A_{275} = 0,70\\). Vad \u00e4r koncentrationen av guanosin?<\/p>\n\n
L\u00f6sning<\/strong><\/p>\n\n
F\u00f6r att l\u00f6sa detta problem m\u00e5ste du anv\u00e4nda Beer’s Law.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Dela sedan b\u00e5da sidor med [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8,33×10-5<\/sup> mol\/L<\/p>\n\n
Exempel 2<\/strong><\/p>\n\n
Det finns ett \u00e4mne i en l\u00f6sning (4 g\/liter). Kyvettens l\u00e4ngd \u00e4r 2 cm och endast 50 % av den best\u00e4mda ljusstr\u00e5len s\u00e4nds ut. Vad \u00e4r absorptionskoefficienten?<\/p>\n\n
L\u00f6sning<\/strong><\/p>\n\n
Med Beer-Lambert Law kan vi ber\u00e4kna absorptionskoefficienten. S\u00e5ledes,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\left(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \\epsilon\\)<\/p>\n\n
D\u00e5 f\u00e5r vi det<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Exempel 3<\/strong><\/p>\n\n
I exempel 2 ovan, hur mycket \u00e4r ljusstr\u00e5len som s\u00e4nds ut n\u00e4r 8 g\/liter?<\/p>\n\n
L\u00f6sning<\/strong><\/p>\n\n
Eftersom vi vet \\(\\epsilon\\), kan vi ber\u00e4kna transmissionen med Beer-Lambert Law. S\u00e5ledes,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
D\u00e4rf\u00f6r \u00e4r \\(I_t\\) = 0,2503 = 25 %<\/p>\n\n
Exempel 4<\/strong><\/p>\n\n
I exempel 2 ovan, vad \u00e4r den mol\u00e4ra absorptionskoefficienten om molekylvikten \u00e4r 100?<\/p>\n\n
L\u00f6sning<\/strong><\/p>\n\n
Det kan enkelt erh\u00e5llas genom att multiplicera absorptionskoefficienten med molekylvikten. S\u00e5ledes,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Exempel 5<\/strong><\/p>\n\n
Absorptionskoefficienten f\u00f6r ett glykogen-jodkomplex \u00e4r 0,20 vid ljus av 450 nm. Vad \u00e4r koncentrationen n\u00e4r transmissionen \u00e4r 40 % i en kyvett p\u00e5 2 cm?<\/p>\n\n
L\u00f6sning<\/strong><\/p>\n\n
Det kan ocks\u00e5 l\u00f6sas med Beer-Lambert Law. D\u00e4rf\u00f6r,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0.4) = 0.20 \\ g\u00e5nger c \\ g\u00e5nger 2\\]<\/p>\n\n
Sedan \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Referenser<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter och Julio de Paula. Fysikalisk kemi f\u00f6r livsvetenskaperna. New York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Fysikalisk kemi f\u00f6r biovetenskaperna. USA: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gore, Michael. Spektrofotometri & Spektrofluorimetri. New York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas och Dwek, Raymond och Wormald, Mark. Principer och problem i fysikalisk kemi f\u00f6r biokemister. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2:a upplagan, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Bidragsgivare och tillskrivningar<\/h2>\n\n
- Fotometer<\/strong> : Efter det \u00f6nskade v\u00e5gl\u00e4ngdsomr\u00e5det f\u00f6r ljuset passerar genom l\u00f6sningen av ett prov i kyvett, detekterar fotometern m\u00e4ngden fotoner som absorberas och skickar sedan en signal till en galvanometer eller en digital display, som illustreras i figur 1.<\/li><\/ul>\n