Na espectrofotometria vis\u00edvel, a absor\u00e7\u00e3o ou a transmiss\u00e3o de uma determinada subst\u00e2ncia podem ser determinadas pela cor observada. Por exemplo, uma amostra de solu\u00e7\u00e3o que absorve a luz sobre todas as gamas vis\u00edveis (ou seja, n\u00e3o transmite nenhum dos comprimentos de onda vis\u00edveis) parece preta em teoria. Por outro lado, se todos os comprimentos de onda vis\u00edveis forem transmitidos (isto \u00e9, n\u00e3o absorve nada), a amostra de solu\u00e7\u00e3o aparece branca. Se uma amostra de solu\u00e7\u00e3o absorver a luz vermelha (~700 nm), parece verde porque o verde \u00e9 a cor complementar do vermelho. Os espectrofot\u00f3metros vis\u00edveis, na pr\u00e1tica, utilizam um prisma para reduzir uma certa gama de comprimentos de onda (para filtrar outros comprimentos de onda) de modo a que o feixe de luz espec\u00edfico seja passado atrav\u00e9s de uma amostra de solu\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n
Dispositivos e mecanismos<\/h2>\n\n
A figura 1 ilustra a estrutura b\u00e1sica dos espectrofot\u00f3metros. \u00c9 constitu\u00edda por uma fonte de luz, um collimator, um monocrom\u00e1tico, um seletor de comprimento de onda, uma cuvette para a solu\u00e7\u00e3o de amostra, um detetor fotoel\u00e9trico, e um ecr\u00e3 digital ou um medidor. O mecanismo detalhado \u00e9 descrito abaixo. A figura 2 mostra um espectrofot\u00f3metro de amostra (Modelo: Espectro: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Um espectrofot\u00f3metro, em geral, \u00e9 composto por dois dispositivos; um espectr\u00f3metro e um fotometro. Um espectr\u00f3metro \u00e9 um dispositivo que produz, normalmente dispersa e mede a luz. Um fotometro indica o detetor fotoel\u00e9trico que mede a intensidade da luz.<\/p>\n\n
- Espectr\u00f3metro<\/strong>: Produz uma gama desejada de comprimento de onda de luz. Primeiro, um colecionador (lente) transmite um feixe reto de luz (fot\u00f5es) que passa atrav\u00e9s de um monocromador (prisma) para dividi-lo em v\u00e1rios comprimentos de onda componentes (espectro). Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) transmite apenas os comprimentos de onda desejados, como mostra a Figura 1.<\/li>
- Fotometro<\/strong>: Ap\u00f3s a gama desejada de comprimento de onda de luz passar atrav\u00e9s da solu\u00e7\u00e3o de uma amostra em cuvette, o fotot\u00e2metro deteta a quantidade de fot\u00f5es que \u00e9 absorvido e, em seguida, envia um sinal para um galvan\u00f3metro ou um ecr\u00e3 digital, como ilustrado na Figura 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 2: Um \u00fanico espectrofot\u00f3metro de comprimento de onda<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Voc\u00ea precisa de um espectr\u00f3metro para produzir uma variedade de comprimentos de onda porque diferentes compostos absorvem melhor em diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, o p-nitrofenol (forma \u00e1cida) tem a absorv\u00e2ncia m\u00e1xima a aproximadamente 320 nm e o p-nitrofenolato (forma b\u00e1sica) absorvem melhor a 400nm, como mostra a Figura 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 3: Absorv\u00e2ncia de dois compostos diferentes<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Olhando para o gr\u00e1fico que mede a absorv\u00e2ncia e o comprimento de onda, tamb\u00e9m pode observar-se um ponto iso\u00f3stico. Um ponto isossbestico<\/strong> \u00e9 o comprimento de onda em que a absorv\u00e2ncia de duas ou mais esp\u00e9cies s\u00e3o as mesmas. O aparecimento de um ponto isosbestico numa rea\u00e7\u00e3o demonstra que um intermedi\u00e1rio N\u00c3O \u00e9 necess\u00e1rio para formar um produto a partir de um reativo. A figura 4 mostra um exemplo de um ponto isossbestico.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 4: Um exemplo de ponto isosbestico (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Referindo-se \u00e0 Figura 1 (e figura 5), a quantidade de fot\u00f5es que passa pela cuvette e pelo detetor depende do comprimento da cuvette e da concentra\u00e7\u00e3o da amostra. Uma vez que voc\u00ea sabe a intensidade da luz depois de passar atrav\u00e9s da cuvette, voc\u00ea pode relacion\u00e1-lo com a transmiss\u00e3o (T). A transmiss\u00e3o \u00e9 a fra\u00e7\u00e3o de luz que passa atrav\u00e9s da amostra. Isto pode ser calculado usando a equa\u00e7\u00e3o:<\/p>\n\n
\\(Transmiss\u00e3o (T) = \\dfrac{I_t}{I_o}\\)<\/p>\n\n
Onde It<\/sub> \u00e9 a intensidade da luz ap\u00f3s o feixe de luz passar atrav\u00e9s da cuvette e Io<\/sub> \u00e9 a intensidade da luz antes que o feixe de luz passe atrav\u00e9s da cuvette. A transmiss\u00e3o est\u00e1 relacionada com a absor\u00e7\u00e3o pela express\u00e3o:<\/p>\n\n
\\(Absorv\u00e2ncia (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o})\\)<\/p>\n\n
Onde a absorv\u00e2ncia representa a quantidade de fot\u00f5es que \u00e9 absorvida. Com a quantidade de absorv\u00e2ncia conhecida da equa\u00e7\u00e3o acima, pode determinar a concentra\u00e7\u00e3o desconhecida da amostra usando a Lei Beer-Lambert. A figura 5 ilustra a transmiss\u00e3o da luz atrav\u00e9s de uma amostra. O comprimento \\(l\\) \u00e9 utilizado para a Lei Beer-Lambert descrita abaixo.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 5: Transmiss\u00e3o (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Lei Beer-Lambert<\/h2>\n\n
A Lei Beer-Lambert<\/a> (tamb\u00e9m conhecida como Lei da Cerveja) estabelece que existe uma rela\u00e7\u00e3o linear entre a absorv\u00e2ncia e a concentra\u00e7\u00e3o de uma amostra. Por esta raz\u00e3o, a Lei da Cerveja s\u00f3<\/em> pode ser aplicada quando h\u00e1 uma rela\u00e7\u00e3o linear. A Lei da Cerveja est\u00e1 escrita como:<\/p>\n\n
\\(A = \\epsilon{lc}\\)<\/p>\n\n
onde<\/p>\n\n
- \\(A\\) \u00e9 a medida de absorv\u00e2ncia (sem unidades),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) \u00e9 o coeficiente de extin\u00e7\u00e3o molar ou absortividade molar (ou coeficiente de absor\u00e7\u00e3o),<\/li>
- \\(l\\) \u00e9 o comprimento do caminho, e<\/li>
- \\(c\\) \u00e9 a concentra\u00e7\u00e3o.<\/li><\/ul>\n
O coeficiente de extin\u00e7\u00e3o molar \u00e9 dado como uma constante e varia para cada mol\u00e9cula. Uma vez que a absorv\u00e2ncia n\u00e3o transporta nenhuma unidade, as unidades para \\(\\epsilon\\) devem cancelar as unidades de comprimento e concentra\u00e7\u00e3o. Como resultado, \\(\\epsilon\\) tem as unidades: L\u00b7mol-1<\/sup>\u00b7cm-1<\/sup>. O comprimento do caminho \u00e9 medido em cent\u00edmetros. Como um espectr\u00f3metro padr\u00e3o utiliza uma cuvette de 1 cm de largura, assume-se sempre que \u00e9 igual a 1 cm. Uma vez que a absor\u00e7\u00e3o, \\(\\epsilon\\), e o comprimento do caminho s\u00e3o conhecidos, podemos calcular a concentra\u00e7\u00e3o \\(c\\) da amostra.<\/p>\n\n
Exemplo 1<\/strong><\/p>\n\n
Guanosine <\/a>tem uma absorv\u00e2ncia m\u00e1xima de 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1}\\) e o comprimento do caminho \u00e9 de 1 cm. Utilizando um espectrofot\u00f3metro, encontra-se o “A_{275}= 0,70\\). Qual \u00e9 a concentra\u00e7\u00e3o de guanosina?<\/p>\n\n
Solu\u00e7\u00e3o<\/strong><\/p>\n\n
Para resolver este problema, tem de usar a Lei da Cerveja.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M-1<\/sup>cm-1<\/sup>)(1 cm)((c\\))<\/p>\n\n
Em seguida, divida ambos os lados por [8400 M-1<\/sup>cm-1<\/sup>)(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8.33×10-5 mol\/L<\/sup><\/p>\n\n
Exemplo 2<\/strong><\/p>\n\n
H\u00e1 uma subst\u00e2ncia numa solu\u00e7\u00e3o (4 g\/litro). O comprimento da cuvette \u00e9 de 2 cm e apenas 50% do feixe de luz \u00e9 transmitido. Qual \u00e9 o coeficiente de absor\u00e7\u00e3o?<\/p>\n\n
Solu\u00e7\u00e3o<\/strong><\/p>\n\n
Usando a Lei Beer-Lambert, podemos calcular o coeficiente de absor\u00e7\u00e3o. Assim,<\/p>\n\n
\\\\\\log \\left\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log (\\dfrac{0.5}{1.0}) = A = {8} \\epsilon\\)<\/p>\n\n
Ent\u00e3o obtemos que<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Exemplo 3<\/strong><\/p>\n\n
No exemplo 2 acima, quanto \u00e9 que o feixe de luz \u00e9 transmitido quando 8 g\/litro ?<\/p>\n\n
Solu\u00e7\u00e3o<\/strong><\/p>\n\n
Uma vez que sabemos \\(\\epsilon\\), podemos calcular a transmiss\u00e3o usando a Lei Beer-Lambert. Assim,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log (I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
Portanto, \\(I_t\\) = 0,2503 = 25%<\/p>\n\n
Exemplo 4<\/strong><\/p>\n\n
Por exemplo, 2 acima, o que \u00e9 o coeficiente de absor\u00e7\u00e3o molar se o peso molecular for de 100?<\/p>\n\n
Solu\u00e7\u00e3o<\/strong><\/p>\n\n
Pode simplesmente obter multiplicando o coeficiente de absor\u00e7\u00e3o pelo peso molecular. Assim,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol-1<\/sup>\u00b7cm-1<\/sup><\/sup><\/sup><\/p>\n\n
Exemplo 5<\/strong><\/p>\n\n
O coeficiente de absor\u00e7\u00e3o de um complexo de glicog\u00e9nio-iodo \u00e9 de 0,20 \u00e0 luz de 450 nm. Qual \u00e9 a concentra\u00e7\u00e3o quando a transmiss\u00e3o \u00e9 de 40 % numa cuvette de 2 cm?<\/p>\n\n
Solu\u00e7\u00e3o<\/strong><\/p>\n\n
Tamb\u00e9m pode ser resolvido usando a Lei Beer-Lambert. Portanto,<\/p>\n\n
\\\\\\ \\log(I_t) = – \\log (0.4) = 0,20 \\vezes c \\vezes 2\\]<\/p>\n\n
Ent\u00e3o \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Refer\u00eancias<\/h2>\n\n
- Atkins, Pedro e J\u00falio de Paula. Qu\u00edmica F\u00edsica para as Ci\u00eancias da Vida. New York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Qu\u00edmica F\u00edsica para as Bioci\u00eancias. EUA: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gore, Michael. Espectrofotometria & Espectrofluormetria. New York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas e Dwek, Raymond e Wormald, Mark. Princ\u00edpios e Problemas em Qu\u00edmica F\u00edsica para Bioqu\u00edmicos. R. G. Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, C\u00e1lculos Bioqu\u00edmicos (Como Resolver Problemas Matem\u00e1ticos em Bioqu\u00edmica Geral), 2\u00aa edi\u00e7\u00e3o, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Contribuintes e Atribui\u00e7\u00f5es<\/h2>\n\n
- Fotometro<\/strong>: Ap\u00f3s a gama desejada de comprimento de onda de luz passar atrav\u00e9s da solu\u00e7\u00e3o de uma amostra em cuvette, o fotot\u00e2metro deteta a quantidade de fot\u00f5es que \u00e9 absorvido e, em seguida, envia um sinal para um galvan\u00f3metro ou um ecr\u00e3 digital, como ilustrado na Figura 1.<\/li><\/ul>\n