{"id":68394,"date":"2022-02-21T11:23:38","date_gmt":"2022-02-21T03:23:38","guid":{"rendered":"https:\/\/qvarz.com\/pomiary-absorbancji-szybki-sposob-na-okreslenie-stezenia-probki\/"},"modified":"2022-02-21T11:23:45","modified_gmt":"2022-02-21T03:23:45","slug":"pomiary-absorbancji-szybki-sposob-na-okreslenie-stezenia-probki","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/pomiary-absorbancji-szybki-sposob-na-okreslenie-stezenia-probki\/","title":{"rendered":"Pomiary absorbancji \u2013 szybki spos\u00f3b na okre\u015blenie st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki"},"content":{"rendered":"\n

W zastosowaniach molekularnych i biochemicznych, a tak\u017ce w diagnostyce medycznej, oznaczanie st\u0119\u017ce\u0144 substancji w roztworze jest kluczowym etapem analizy. Cz\u0119sto w tym celu stosuje si\u0119 metody fotometryczne, poniewa\u017c mo\u017cna je przeprowadzi\u0107 \u0142atwo i szybko, a tak\u017ce poniewa\u017c cz\u0119sto stanowi\u0105 one najbardziej op\u0142acaln\u0105 opcj\u0119.<\/strong><\/p>\n\n

Og\u00f3lnie rzecz bior\u0105c, metody (spektro)-fotometryczne opieraj\u0105 si\u0119 na zasadzie, \u017ce cz\u0105steczki w roztworze poch\u0142aniaj\u0105 \u015bwiat\u0142o, a os\u0142abione w ten spos\u00f3b \u015bwiat\u0142o jest mierzone za pomoc\u0105 detektora. Jak sugeruje nazwa, spektrofotometry UV\/Vis wykorzystuj\u0105 \u015bwiat\u0142o widzialne i ultrafioletowe w zakresie d\u0142ugo\u015bci fal od oko\u0142o 200 do 900 nm.<\/p>\n\n

W celu okre\u015blenia st\u0119\u017cenia analitu najcz\u0119\u015bciej wykorzystuje si\u0119 d\u0142ugo\u015b\u0107 fali, przy kt\u00f3rej cz\u0105steczka wykazuje najwy\u017csz\u0105 absorbancj\u0119 (szczytowa d\u0142ugo\u015b\u0107 fali). Na przyk\u0142ad w przypadku kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek by\u0142oby to odpowiednio 260 nm i 280 nm. Podstaw\u0105 obliczania st\u0119\u017cenia substancji na podstawie pomiar\u00f3w fotometrycznych s\u0105 prawa fizyki opisane prawem Lamberta-Beera. Dzieje si\u0119 to zgodnie z etapami wzor\u00f3w wymienionych poni\u017cej:<\/p>\n\n

  1. Transmisja lub transmitancja (T) = I\/I 0<\/sub>Transmisj\u0119 okre\u015bla si\u0119 w fotometrze, wykorzystuj\u0105c stosunek \u015bwiat\u0142a wychodz\u0105cego do \u015bwiat\u0142a wpadaj\u0105cego do pr\u00f3bki.<\/li>
  2. Absorbancja (A) = log (I 0<\/sub> \/I)Absorbancja jest obliczana z ujemnego logarytmu dziesi\u0119tnego transmisji.<\/li>
  3. Absorbancja (A) = C x L x \u0190 => St\u0119\u017cenie (C) = A\/(L x \u0190)Prawo Lamberta-Beera opisuje zale\u017cno\u015b\u0107 absorbancji od st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki (C), d\u0142ugo\u015bci drogi optycznej (L) oraz zale\u017cno\u015b\u0107 od specyficznego dla pr\u00f3bki wsp\u00f3\u0142czynnika ekstynkcji (\u0190), kt\u00f3ry dotyczy konkretnej substancji na okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali. St\u0119\u017cenie pr\u00f3bki jest nast\u0119pnie obliczane poprzez przekszta\u0142cenie wzoru.<\/li><\/ol>\n

    Te trzy stwierdzenia opisano bardziej szczeg\u00f3\u0142owo poni\u017cej.<\/p>\n\n

    Okre\u015blenie transmisji (T = I\/I 0<\/sub> )<\/strong><\/p>\n\n

    \"\"<\/a>
    Rysunek 1: Uproszczony monta\u017c fotometru przedstawiaj\u0105cego pr\u00f3bk\u0119 i parametry, kt\u00f3re s\u0105 istotne dla prawa Lamberta-Beera<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

    I 0<\/sub> : \u015awiat\u0142o wchodz\u0105ce do pr\u00f3bkiI: \u015awiat\u0142o wychodz\u0105ce z pr\u00f3bkiC: St\u0119\u017cenie pr\u00f3bkiL: \u015bcie\u017cka \u015bwiat\u0142a\/grubo\u015b\u0107 pr\u00f3bki\u0190: Wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji<\/em><\/p>\n\n

    Zasadniczo fotometr sk\u0142ada si\u0119 ze \u017ar\u00f3d\u0142a \u015bwiat\u0142a, miejsca, w kt\u00f3rym znajduje si\u0119 pr\u00f3bka, oraz detektora (rysunek 1). Detektor mierzy intensywno\u015b\u0107 \u015bwiat\u0142a przechodz\u0105cego przez pr\u00f3bk\u0119. Oczywi\u015bcie istnieje szereg innych sk\u0142adnik\u00f3w; w szczeg\u00f3lno\u015bci elementy optyczne, kt\u00f3re za\u0142amuj\u0105 \u015bwiat\u0142o i rozdzielaj\u0105 je na poszczeg\u00f3lne d\u0142ugo\u015bci fal, a tak\u017ce elementy odbijaj\u0105ce lub przepuszczaj\u0105ce \u015bwiat\u0142o.<\/p>\n\n

    \u0179r\u00f3d\u0142o \u015bwiat\u0142a fotometru emituje \u015bwiat\u0142o o okre\u015blonym nat\u0119\u017ceniu I 0<\/sub> , kt\u00f3re jest prowadzone przez roztw\u00f3r pr\u00f3bki. Cz\u0119\u015b\u0107 \u015bwiat\u0142a zostanie poch\u0142oni\u0119ta przez pr\u00f3bk\u0119. Cz\u0119\u015b\u0107, kt\u00f3ra przechodzi przez pr\u00f3bk\u0119, jest rejestrowana przez detektor jako nat\u0119\u017cenie I. Stosunek I\/I 0<\/sub> opisuje transmisj\u0119 pr\u00f3bki przy okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali.<\/p>\n\n

    Obliczanie absorbancji (A = log (I 0<\/sub> \/I)<\/strong><\/p>\n\n

    Nowoczesne fotometry automatycznie przetwarzaj\u0105 transmisj\u0119 pr\u00f3bki na absorbancj\u0119, kt\u00f3ra jest definiowana jako ujemny logarytm dziesi\u0119tny transmisji. Powstaje pytanie, dlaczego transmisja nie jest bezpo\u015brednio wykorzystywana do obliczania st\u0119\u017cenia pr\u00f3bki. Rysunek 2 wyja\u015bnia zwi\u0105zek mi\u0119dzy transmisj\u0105 a absorbancj\u0105. Je\u015bli kilka pr\u00f3bek, z kt\u00f3rych ka\u017cda przepuszcza 50 % \u015bwiat\u0142a wpadaj\u0105cego do pr\u00f3bki, zostanie po\u0142\u0105czonych szeregowo, otrzymamy wyk\u0142adnicz\u0105 krzyw\u0105 przepuszczalno\u015bci, pokazan\u0105 poni\u017cej. Je\u015bli zamiast tego warto\u015bci s\u0105 wyra\u017cane w spos\u00f3b logarytmiczny, powstanie zale\u017cno\u015b\u0107 liniowa. W ten spos\u00f3b absorbancja jest proporcjonalna do st\u0119\u017cenia (jak r\u00f3wnie\u017c do d\u0142ugo\u015bci drogi), co znacznie upraszcza obliczenia.<\/p>\n\n

    Rysunek 2: Zwi\u0105zek mi\u0119dzy przepuszczalno\u015bci\u0105 a poch\u0142anianiem \u015bwiat\u0142a:<\/strong><\/p>\n\n

    \"\"<\/a>
    a) \u0141\u0105czenie pr\u00f3bek szeregowo, z kt\u00f3rych ka\u017cda umo\u017cliwia przepuszczanie 50 % \u015bwiat\u0142a wpadaj\u0105cego do pr\u00f3bki. Procent dotyczy pocz\u0105tkowego nat\u0119\u017cenia \u015bwiat\u0142a.<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n
    \"\"<\/a>
    b) Wyk\u0142adniczo malej\u0105ca krzywa transmisji<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n
    \"\"<\/a>
    c) Graficzne przedstawienie absorbancji (z wykorzystaniem logarytmu dziesi\u0119cioletniego transmisji)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n

    Obliczanie st\u0119\u017cenia (C = A\/(L x \u0190))<\/strong><\/p>\n\n

    Aby wyprowadzi\u0107 st\u0119\u017cenie pr\u00f3bki na podstawie jej absorbancji, wymagane s\u0105 dodatkowe informacje. Prawo Lamberta-Beera, kt\u00f3re stanowi fizyczn\u0105 podstaw\u0119 zastosowa\u0144 fotometrycznych, opisuje, \u017ce absorpcja \u015bwiat\u0142a przez pr\u00f3bk\u0119 jest wprost proporcjonalna do jej st\u0119\u017cenia i d\u0142ugo\u015bci drogi. Na warto\u015b\u0107 absorbancji pr\u00f3bki sk\u0142adaj\u0105 si\u0119 \u0142\u0105cznie trzy parametry: po pierwsze, st\u0119\u017cenie (C) cz\u0105steczki; po drugie, d\u0142ugo\u015b\u0107 drogi (L) pr\u00f3bki, kt\u00f3ra og\u00f3lnie jest r\u00f3wna d\u0142ugo\u015bci drogi kuwety. Nast\u0119pnie mamy wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji (\u0190). Wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji jest sta\u0142\u0105 fizyczn\u0105 unikaln\u0105 dla cz\u0105steczki; opisuje jego w\u0142a\u015bciwo\u015b\u0107 poch\u0142aniania \u015bwiat\u0142a o okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali. Ta specyficzna dla materia\u0142u sta\u0142a jest znana dla wielu substancji, w tym kwas\u00f3w nukleinowych i r\u00f3\u017cnych bia\u0142ek, a warto\u015bci zosta\u0142y opublikowane w odpowiedniej literaturze. W takich przypadkach st\u0119\u017cenie mo\u017cna okre\u015bli\u0107 natychmiast. Je\u015bli jednak warto\u015b\u0107 nie jest znana, mo\u017cna skorzysta\u0107 z pomocy krzywej kalibracyjnej. Do wygenerowania krzywej kalibracyjnej wymagane s\u0105 wzorce, czyli roztwory, kt\u00f3re zawieraj\u0105 znane st\u0119\u017cenia analizowanych substancji. S\u0105 one mierzone w fotometrze przed w\u0142a\u015bciw\u0105 pr\u00f3bk\u0105. St\u0119\u017cenie analitu jest nast\u0119pnie obliczane przy u\u017cyciu krzywej standardowej.<\/p>\n\n

    Poza kwantyfikacj\u0105 pomiary absorbancji mog\u0105 r\u00f3wnie\u017c ujawni\u0107 jako\u015bciowe informacje o pr\u00f3bce: na przyk\u0142ad czysto\u015b\u0107 kwas\u00f3w nukleinowych i bia\u0142ek mo\u017cna okre\u015bli\u0107, poddaj\u0105c pr\u00f3bk\u0119 pomiarom przy dodatkowych czas.<\/p>\n\n

    \u0179r\u00f3d\u0142o<\/a><\/p>\n\n

    <\/p>\n\n

    <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

    W zastosowaniach molekularnych i biochemicznych, a tak\u017ce w diagnostyce medycznej, oznaczanie st\u0119\u017ce\u0144 substancji w roztworze jest kluczowym etapem analizy. Cz\u0119sto w tym celu stosuje si\u0119 metody fotometryczne, poniewa\u017c mo\u017cna je przeprowadzi\u0107 \u0142atwo i szybko, a tak\u017ce poniewa\u017c cz\u0119sto stanowi\u0105 one najbardziej op\u0142acaln\u0105 opcj\u0119. Og\u00f3lnie rzecz bior\u0105c, metody (spektro)-fotometryczne opieraj\u0105 si\u0119 na zasadzie, \u017ce cz\u0105steczki w<\/p>\n

    Read More<\/a><\/div>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_uag_custom_page_level_css":"","ub_ctt_via":"","footnotes":""},"categories":[814,820],"tags":[],"class_list":["post-68394","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-spektrofotometria","category-wszystkie-posty"],"featured_image_src":null,"author_info":{"display_name":"admin","author_link":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/author\/admin\/"},"uagb_featured_image_src":{"full":false,"thumbnail":false,"medium":false,"medium_large":false,"large":false,"1536x1536":false,"2048x2048":false,"bacola-woo-product":false,"woocommerce_thumbnail":false,"woocommerce_single":false,"woocommerce_gallery_thumbnail":false,"variation_swatches_image_size":false,"variation_swatches_tooltip_size":false,"dgwt-wcas-product-suggestion":false},"uagb_author_info":{"display_name":"admin","author_link":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/author\/admin\/"},"uagb_comment_info":0,"uagb_excerpt":"W zastosowaniach molekularnych i biochemicznych, a tak\u017ce w diagnostyce medycznej, oznaczanie st\u0119\u017ce\u0144 substancji w roztworze jest kluczowym etapem analizy. Cz\u0119sto w tym celu stosuje si\u0119 metody fotometryczne, poniewa\u017c mo\u017cna je przeprowadzi\u0107 \u0142atwo i szybko, a tak\u017ce poniewa\u017c cz\u0119sto stanowi\u0105 one najbardziej op\u0142acaln\u0105 opcj\u0119. Og\u00f3lnie rzecz bior\u0105c, metody (spektro)-fotometryczne opieraj\u0105 si\u0119 na zasadzie, \u017ce cz\u0105steczki wRead…","_links":{"self":[{"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/68394","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=68394"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/68394\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":68396,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/68394\/revisions\/68396"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=68394"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=68394"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/qvarz.com\/pl\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=68394"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}