Nella spettrofotometria visibile, l’assorbimento o la trasmissione di una certa sostanza pu\u00f2 essere determinato dal colore osservato. Ad esempio, un campione di soluzione che assorbe la luce su tutte le gamme visibili (cio\u00e8, non trasmette nessuna delle lunghezze d’onda visibili) in teoria appare nero. D’altra parte, se tutte le lunghezze d’onda visibili vengono trasmesse (cio\u00e8 non assorbe nulla), il campione di soluzione appare bianco. Se un campione di soluzione assorbe luce rossa (~700 nm), appare verde perch\u00e9 il verde \u00e8 il colore complementare del rosso. Gli spettrofotometri visibili, in pratica, utilizzano un prisma per restringere un certo intervallo di lunghezze d’onda (per filtrare altre lunghezze d’onda) in modo che il particolare fascio di luce venga fatto passare attraverso un campione di soluzione.<\/p>\n\n
Dispositivi e meccanismo<\/h2>\n\n
La figura 1 illustra la struttura di base degli spettrofotometri. \u00c8 costituito da una sorgente luminosa, un collimatore, un monocromatore, un selettore di lunghezza d’onda, una cuvetta per la soluzione campione, un rivelatore fotoelettrico e un display digitale o un misuratore. Il meccanismo dettagliato \u00e8 descritto di seguito. La figura 2 mostra uno spettrofotometro campione (modello: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Uno spettrofotometro, in generale, \u00e8 costituito da due dispositivi; uno spettrometro e un fotometro. Uno spettrometro \u00e8 un dispositivo che produce, in genere disperde e misura la luce. Un fotometro indica il rivelatore fotoelettrico che misura l’intensit\u00e0 della luce.<\/p>\n\n
- Spettrometro<\/strong> : produce una gamma di lunghezza d’onda della luce desiderata. Innanzitutto un collimatore (lente) trasmette un raggio di luce rettilineo (fotoni) che passa attraverso un monocromatore (prisma) per dividerlo in diverse lunghezze d’onda componenti (spettro). Quindi un selettore di lunghezza d’onda (fessura) trasmette solo le lunghezze d’onda desiderate, come mostrato nella Figura 1.<\/li>
- Fotometro<\/strong> : dopo che l’intervallo di lunghezza d’onda della luce desiderato \u00e8 passato attraverso la soluzione di un campione in cuvetta, il fotometro rileva la quantit\u00e0 di fotoni che viene assorbita e quindi invia un segnale a un galvanometro o a un display digitale, come illustrato nella Figura 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 2: uno spettrofotometro a lunghezza d’onda singola<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n \u00c8 necessario uno spettrometro per produrre una variet\u00e0 di lunghezze d’onda perch\u00e9 diversi composti assorbono meglio a diverse lunghezze d’onda. Ad esempio, il p-nitrofenolo (forma acida) ha l’assorbimento massimo a circa 320 nm e il p-nitrofenolato (forma base) si assorbe meglio a 400 nm, come mostrato nella Figura 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 3: Assorbanza di due diversi composti<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Osservando il grafico che misura l’assorbanza e la lunghezza d’onda, si pu\u00f2 anche osservare un punto isosbestico. Un punto isosbestico<\/strong> \u00e8 la lunghezza d’onda in cui l’assorbanza di due o pi\u00f9 specie \u00e8 la stessa. La comparsa di un punto isosbestico in una reazione dimostra che NON \u00e8 necessario un intermedio per formare un prodotto da un reagente. La figura 4 mostra un esempio di punto isosbestico.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 4: Un esempio di punto isosbestico (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Facendo riferimento alla Figura 1 (e alla Figura 5), la quantit\u00e0 di fotoni che passa attraverso la cuvetta e nel rivelatore dipende dalla lunghezza della cuvetta e dalla concentrazione del campione. Una volta che conosci l’intensit\u00e0 della luce dopo che \u00e8 passata attraverso la cuvetta, puoi metterla in relazione con la trasmittanza (T). La trasmittanza \u00e8 la frazione di luce che passa attraverso il campione. Questo pu\u00f2 essere calcolato usando l’equazione:<\/p>\n\n
\\(Trasmittanza (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
Dove<\/sub> I \u00e8 l’intensit\u00e0 della luce dopo che il raggio di luce \u00e8 passato attraverso la cuvetta e I o<\/sub> \u00e8 l’intensit\u00e0 della luce prima che il raggio di luce attraversi la cuvetta. La trasmittanza \u00e8 correlata all’assorbimento da parte dell’espressione:<\/p>\n\n
\\(Assorbanza (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
Dove assorbanza sta per la quantit\u00e0 di fotoni che viene assorbita. Con la quantit\u00e0 di assorbanza nota dall’equazione sopra, \u00e8 possibile determinare la concentrazione sconosciuta del campione utilizzando la legge di Beer-Lambert. La figura 5 illustra la trasmissione della luce attraverso un campione. La lunghezza \\(l\\) viene utilizzata per la legge Beer-Lambert descritta di seguito.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 5: Trasmittanza (CC BY-4.0; Heesung Shim tramite LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Legge Birra-Lambert<\/h2>\n\n
Beer-Lambert Law<\/a> (nota anche come Beer’s Law) afferma che esiste una relazione lineare tra l’assorbanza e la concentrazione di un campione. Per questo motivo, la legge di Beer pu\u00f2 essere applicata solo<\/em> quando esiste una relazione lineare. La legge della birra \u00e8 scritta come:<\/p>\n\n
\\(LA = \\epsilon{lc} \\)<\/p>\n\n
dove<\/p>\n\n
- \\(A\\) \u00e8 la misura dell’assorbanza (nessuna unit\u00e0),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) \u00e8 il coefficiente di estinzione molare o assorbimento molare (o coefficiente di assorbimento),<\/li>
- \\(l\\) \u00e8 la lunghezza del percorso, e<\/li>
- \\(c\\) \u00e8 la concentrazione.<\/li><\/ul>\n
Il coefficiente di estinzione molare \u00e8 dato come costante e varia per ciascuna molecola. Poich\u00e9 l’assorbanza non trasporta alcuna unit\u00e0, le unit\u00e0 per \\(\\epsilon\\) devono annullare le unit\u00e0 di lunghezza e concentrazione. Di conseguenza, \\(\\epsilon\\) ha le unit\u00e0: L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . La lunghezza del percorso \u00e8 misurata in centimetri. Poich\u00e9 uno spettrometro standard utilizza una cuvetta larga 1 cm, si presume che \\(l\\) sia sempre uguale a 1 cm. Poich\u00e9 l’assorbimento, \\(\\epsilon\\) e la lunghezza del percorso sono noti, possiamo calcolare la concentrazione \\(c\\) del campione.<\/p>\n\n
Esempio 1<\/strong><\/p>\n\n
La guanosina<\/a> ha un’assorbanza massima di 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) e la lunghezza del percorso \u00e8 1 cm. Usando uno spettrofotometro, trovi che \\(A_{275} = 0,70\\). Qual \u00e8 la concentrazione di guanosina?<\/p>\n\n
Soluzione<\/strong><\/p>\n\n
Per risolvere questo problema, devi usare la legge di Beer.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Quindi, dividi entrambi i lati per [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8,33×10 -5<\/sup> mol\/L<\/p>\n\n
Esempio 2<\/strong><\/p>\n\n
C’\u00e8 una sostanza in una soluzione (4 g\/litro). La lunghezza della cuvetta \u00e8 di 2 cm e viene trasmesso solo il 50% di un determinato raggio di luce. Qual \u00e8 il coefficiente di assorbimento?<\/p>\n\n
Soluzione<\/strong><\/p>\n\n
Usando la legge di Beer-Lambert, possiamo calcolare il coefficiente di assorbimento. Cos\u00ec,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\left(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \\epsilon\\)<\/p>\n\n
Quindi lo otteniamo<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Esempio 3<\/strong><\/p>\n\n
Nell’esempio 2 sopra, quanto viene trasmesso il raggio di luce quando 8 g\/litro ?<\/p>\n\n
Soluzione<\/strong><\/p>\n\n
Poich\u00e9 conosciamo \\(\\epsilon\\), possiamo calcolare la trasmissione usando la legge di Beer-Lambert. Cos\u00ec,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
Pertanto, \\(I_t\\) = 0,2503 = 25%<\/p>\n\n
Esempio 4<\/strong><\/p>\n\n
Nell’esempio 2 sopra, qual \u00e8 il coefficiente di assorbimento molare se il peso molecolare \u00e8 100?<\/p>\n\n
Soluzione<\/strong><\/p>\n\n
Si ottiene semplicemente moltiplicando il coefficiente di assorbimento per il peso molecolare. Cos\u00ec,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Esempio 5<\/strong><\/p>\n\n
Il coefficiente di assorbimento di un complesso glicogeno-iodio \u00e8 0,20 alla luce di 450 nm. Qual \u00e8 la concentrazione quando la trasmissione \u00e8 del 40 % in una cuvetta di 2 cm?<\/p>\n\n
Soluzione<\/strong><\/p>\n\n
Pu\u00f2 anche essere risolto usando la legge Beer-Lambert. Perci\u00f2,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0.4) = 0.20 \\times c \\times 2\\]<\/p>\n\n
Allora \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Riferimenti<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter e Julio de Paula. Chimica fisica per le scienze della vita. New York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Chimica fisica per le bioscienze. USA: University Science Books, 2005.<\/li>
- Accidenti, Michele. Spettrofotometria e spettrofluorimetria. New York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas e Dwek, Raymond e Wormald, Mark. Principi e problemi di chimica fisica per i biochimici. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, Calcoli biochimici (Come risolvere i problemi matematici nella biochimica generale), 2a edizione, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Contributi e attribuzioni<\/h2>\n\n
- Fotometro<\/strong> : dopo che l’intervallo di lunghezza d’onda della luce desiderato \u00e8 passato attraverso la soluzione di un campione in cuvetta, il fotometro rileva la quantit\u00e0 di fotoni che viene assorbita e quindi invia un segnale a un galvanometro o a un display digitale, come illustrato nella Figura 1.<\/li><\/ul>\n