En spectrophotom\u00e9trie visible, l’absorption ou la transmission d’une certaine substance peut \u00eatre d\u00e9termin\u00e9e par la couleur observ\u00e9e. Par exemple, un \u00e9chantillon de solution qui absorbe la lumi\u00e8re sur toutes les gammes visibles (c’est-\u00e0-dire, ne transmet aucune des longueurs d’onde visibles) appara\u00eet noir en th\u00e9orie. D’autre part, si toutes les longueurs d’onde visibles sont transmises (c’est-\u00e0-dire qu’elles n’absorbent rien), l’\u00e9chantillon de solution appara\u00eet blanc. Si un \u00e9chantillon de solution absorbe la lumi\u00e8re rouge (~ 700 nm), il appara\u00eet vert car le vert est la couleur compl\u00e9mentaire du rouge. Les spectrophotom\u00e8tres visibles, en pratique, utilisent un prisme pour r\u00e9duire une certaine gamme de longueurs d’onde (pour filtrer d’autres longueurs d’onde) afin que le faisceau de lumi\u00e8re particulier passe \u00e0 travers un \u00e9chantillon de solution.<\/p>\n\n
Dispositifs et m\u00e9canisme<\/h2>\n\n
La figure 1 illustre la structure de base des spectrophotom\u00e8tres. Il se compose d’une source lumineuse, d’un collimateur, d’un monochromateur, d’un s\u00e9lecteur de longueur d’onde, d’une cuvette pour la solution d’\u00e9chantillon, d’un d\u00e9tecteur photo\u00e9lectrique et d’un affichage num\u00e9rique ou d’un compteur. Le m\u00e9canisme d\u00e9taill\u00e9 est d\u00e9crit ci-dessous. La figure 2 montre un \u00e9chantillon de spectrophotom\u00e8tre (mod\u00e8le : Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Un spectrophotom\u00e8tre, en g\u00e9n\u00e9ral, se compose de deux appareils\u00a0; un spectrom\u00e8tre et un photom\u00e8tre. Un spectrom\u00e8tre est un appareil qui produit, disperse et mesure g\u00e9n\u00e9ralement la lumi\u00e8re. Un photom\u00e8tre d\u00e9signe le d\u00e9tecteur photo\u00e9lectrique qui mesure l’intensit\u00e9 de la lumi\u00e8re.<\/p>\n\n
- Spectrom\u00e8tre<\/strong> : Il produit une gamme souhait\u00e9e de longueur d’onde de lumi\u00e8re. Tout d’abord, un collimateur (lentille) transmet un faisceau droit de lumi\u00e8re (photons) qui traverse un monochromateur (prisme) pour le diviser en plusieurs longueurs d’onde composantes (spectre). Ensuite, un s\u00e9lecteur de longueur d’onde (fente) ne transmet que les longueurs d’onde souhait\u00e9es, comme illustr\u00e9 \u00e0 la figure 1.<\/li>
- Photom\u00e8tre<\/strong> : Apr\u00e8s que la gamme souhait\u00e9e de longueur d’onde de lumi\u00e8re traverse la solution d’un \u00e9chantillon dans une cuvette, le photom\u00e8tre d\u00e9tecte la quantit\u00e9 de photons qui est absorb\u00e9e, puis envoie un signal \u00e0 un galvanom\u00e8tre ou \u00e0 un affichage num\u00e9rique, comme illustr\u00e9 \u00e0 la figure 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figure 2 : Un spectrophotom\u00e8tre \u00e0 une seule longueur d’onde<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Vous avez besoin d’un spectrom\u00e8tre pour produire une vari\u00e9t\u00e9 de longueurs d’onde car diff\u00e9rents compos\u00e9s absorbent mieux \u00e0 diff\u00e9rentes longueurs d’onde. Par exemple, le p-nitroph\u00e9nol (forme acide) a l’absorbance maximale \u00e0 environ 320 nm et le p-nitroph\u00e9nolate (forme basique) absorbe mieux \u00e0 400 nm, comme le montre la figure 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figure 3 : Absorbance de deux compos\u00e9s diff\u00e9rents<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n En regardant le graphique qui mesure l’absorbance et la longueur d’onde, un point isobestique peut \u00e9galement \u00eatre observ\u00e9. Un point isobestique<\/strong> est la longueur d’onde dans laquelle l’absorbance de deux esp\u00e8ces ou plus est la m\u00eame. L’apparition d’un point isobestique dans une r\u00e9action d\u00e9montre qu’un interm\u00e9diaire n’est PAS n\u00e9cessaire pour former un produit \u00e0 partir d’un r\u00e9actif. La figure 4 montre un exemple de point isobestique.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figure 4 : Un exemple de point isobestique (CC BY-4.0 ; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n En se r\u00e9f\u00e9rant \u00e0 la figure 1 (et \u00e0 la figure 5), la quantit\u00e9 de photons qui traverse la cuvette et dans le d\u00e9tecteur d\u00e9pend de la longueur de la cuvette et de la concentration de l’\u00e9chantillon. Une fois que vous connaissez l’intensit\u00e9 de la lumi\u00e8re apr\u00e8s son passage dans la cuvette, vous pouvez la relier \u00e0 la transmission (T). La transmittance est la fraction de lumi\u00e8re qui traverse l’\u00e9chantillon. Cela peut \u00eatre calcul\u00e9 \u00e0 l’aide de l’\u00e9quation :<\/p>\n\n
\\(Transmittance (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
O\u00f9 I t<\/sub> est l’intensit\u00e9 lumineuse apr\u00e8s que le faisceau lumineux traverse la cuvette et I o<\/sub> est l’intensit\u00e9 lumineuse avant que le faisceau lumineux traverse la cuvette. La transmittance est li\u00e9e \u00e0 l’absorption par l’expression :<\/p>\n\n
\\(Absorbance (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
O\u00f9 l’absorbance repr\u00e9sente la quantit\u00e9 de photons qui est absorb\u00e9e. Avec la quantit\u00e9 d’absorbance connue \u00e0 partir de l’\u00e9quation ci-dessus, vous pouvez d\u00e9terminer la concentration inconnue de l’\u00e9chantillon en utilisant la loi de Beer-Lambert. La figure 5 illustre la transmission de la lumi\u00e8re \u00e0 travers un \u00e9chantillon. La longueur \\(l\\) est utilis\u00e9e pour la loi de Beer-Lambert d\u00e9crite ci-dessous.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figure 5 : Transmittance (CC BY-4.0 ; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Loi Beer-Lambert<\/h2>\n\n
La loi de Beer-Lambert<\/a> (\u00e9galement connue sous le nom de loi de Beer) stipule qu’il existe une relation lin\u00e9aire entre l’absorbance et la concentration d’un \u00e9chantillon. Pour cette raison, la loi de Beer ne<\/em> peut \u00eatre appliqu\u00e9e que lorsqu’il existe une relation lin\u00e9aire. La loi de Beer s’\u00e9crit :<\/p>\n\n
\\(A = \\epsilon{lc} \\)<\/p>\n\n
o\u00f9<\/p>\n\n
- \\(A\\) est la mesure de l’absorbance (pas d’unit\u00e9s),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) est le coefficient d’extinction molaire ou l’absorptivit\u00e9 molaire (ou coefficient d’absorption),<\/li>
- \\(l\\) est la longueur du chemin, et<\/li>
- \\(c\\) est la concentration.<\/li><\/ul>\n
Le coefficient d’extinction molaire est donn\u00e9 sous forme de constante et varie pour chaque mol\u00e9cule. Puisque l’absorbance ne porte aucune unit\u00e9, les unit\u00e9s pour \\(\\epsilon\\) doivent annuler les unit\u00e9s de longueur et de concentration. Par cons\u00e9quent, \\(\\epsilon\\) a pour unit\u00e9s : L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . La longueur du trajet est mesur\u00e9e en centim\u00e8tres. \u00c9tant donn\u00e9 qu’un spectrom\u00e8tre standard utilise une cuvette de 1 cm de largeur, \\(l\\) est toujours suppos\u00e9 \u00e9gal \u00e0 1 cm. Puisque l’absorption, \\(\\epsilon\\) et la longueur du trajet sont connues, nous pouvons calculer la concentration \\(c\\) de l’\u00e9chantillon.<\/p>\n\n
Exemple 1<\/strong><\/p>\n\n
La guanosine<\/a> a une absorbance maximale de 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) et la longueur du chemin est de 1 cm. \u00c0 l’aide d’un spectrophotom\u00e8tre, vous trouvez que \\(A_{275} = 0,70\\). Quelle est la concentration de guanosine ?<\/p>\n\n
Solution<\/strong><\/p>\n\n
Pour r\u00e9soudre ce probl\u00e8me, vous devez utiliser la loi de Beer.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Ensuite, divisez les deux c\u00f4t\u00e9s par [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8,33×10 -5<\/sup> mol\/L<\/p>\n\n
Exemple 2<\/strong><\/p>\n\n
Il y a une substance dans une solution (4 g\/litre). La longueur de la cuvette est de 2 cm et seulement 50% du certain faisceau lumineux est transmis. Qu’est-ce que le coefficient d’absorption ?<\/p>\n\n
Solution<\/strong><\/p>\n\n
En utilisant la loi de Beer-Lambert, nous pouvons calculer le coefficient d’absorption. Ainsi,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\left(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0.5}{1.0}) = UNE ={8} \\epsilon\\)<\/p>\n\n
On obtient alors que<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Exemple 3<\/strong><\/p>\n\n
Dans l’exemple 2 ci-dessus, combien le faisceau lumineux est-il transmis lorsque 8 g\/litre ?<\/p>\n\n
Solution<\/strong><\/p>\n\n
Puisque nous connaissons \\(\\epsilon\\), nous pouvons calculer la transmission en utilisant la loi de Beer-Lambert. Ainsi,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
Par cons\u00e9quent, \\(I_t\\) = 0,2503 = 25\u00a0%<\/p>\n\n
Exemple 4<\/strong><\/p>\n\n
Dans l’exemple 2 ci-dessus, quel est le coefficient d’absorption molaire si le poids mol\u00e9culaire est de 100\u00a0?<\/p>\n\n
Solution<\/strong><\/p>\n\n
Il peut simplement \u00eatre obtenu en multipliant le coefficient d’absorption par le poids mol\u00e9culaire. Ainsi,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Exemple 5<\/strong><\/p>\n\n
Le coefficient d’absorption d’un complexe glycog\u00e8ne-iode est de 0,20 \u00e0 la lumi\u00e8re de 450 nm. Quelle est la concentration lorsque la transmission est de 40 % dans une cuvette de 2 cm ?<\/p>\n\n
Solution<\/strong><\/p>\n\n
Il peut \u00e9galement \u00eatre r\u00e9solu en utilisant la loi de Beer-Lambert. Donc,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0.4) = 0.20 \\times c \\times 2\\]<\/p>\n\n
Alors \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Les r\u00e9f\u00e9rences<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter et Julio de Paula. Physico-chimie pour les sciences du vivant. New York : Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Physico-chimie pour les biosciences. \u00c9tats-Unis: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gor\u00e9, Michael. Spectrophotom\u00e9trie & Spectrofluorim\u00e9trie. New York : Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas et Dwek, Raymond et Wormald, Mark. Principes et probl\u00e8mes de chimie physique pour les biochimistes. RG Ratcliffe. New York : Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, Calculs biochimiques (Comment r\u00e9soudre des probl\u00e8mes math\u00e9matiques en biochimie g\u00e9n\u00e9rale), 2e \u00e9dition, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Contributeurs et attributions<\/h2>\n\n
- Photom\u00e8tre<\/strong> : Apr\u00e8s que la gamme souhait\u00e9e de longueur d’onde de lumi\u00e8re traverse la solution d’un \u00e9chantillon dans une cuvette, le photom\u00e8tre d\u00e9tecte la quantit\u00e9 de photons qui est absorb\u00e9e, puis envoie un signal \u00e0 un galvanom\u00e8tre ou \u00e0 un affichage num\u00e9rique, comme illustr\u00e9 \u00e0 la figure 1.<\/li><\/ul>\n