En espectrofotometr\u00eda visible, la absorci\u00f3n o la transmisi\u00f3n de una determinada sustancia se puede determinar por el color observado. Por ejemplo, una muestra de soluci\u00f3n que absorbe luz en todos los rangos visibles (es decir, no transmite ninguna de las longitudes de onda visibles) parece negra en teor\u00eda. Por otro lado, si se transmiten todas las longitudes de onda visibles (es decir, no absorbe nada), la muestra de soluci\u00f3n aparece blanca. Si una muestra de soluci\u00f3n absorbe luz roja (~700 nm), aparece verde porque el verde es el color complementario del rojo. Los espectrofot\u00f3metros visibles, en la pr\u00e1ctica, usan un prisma para reducir un cierto rango de longitud de onda (para filtrar otras longitudes de onda) de modo que el haz de luz particular pase a trav\u00e9s de una muestra de soluci\u00f3n.<\/p>\n\n
Dispositivos y mecanismo<\/h2>\n\n
La figura 1 ilustra la estructura b\u00e1sica de los espectrofot\u00f3metros. Consta de una fuente de luz, un colimador, un monocromador, un selector de longitud de onda, una cubeta para soluci\u00f3n de muestra, un detector fotoel\u00e9ctrico y una pantalla digital o un medidor. El mecanismo detallado se describe a continuaci\u00f3n. La Figura 2 muestra un espectrofot\u00f3metro de muestra (Modelo: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/espectrometría-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Un espectrofot\u00f3metro, en general, consta de dos dispositivos; un espectr\u00f3metro y un fot\u00f3metro. Un espectr\u00f3metro es un dispositivo que produce, normalmente dispersa y mide la luz. Un fot\u00f3metro indica el detector fotoel\u00e9ctrico que mide la intensidad de la luz.<\/p>\n\n
- Espectr\u00f3metro<\/strong> : produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero, un colimador (lente) transmite un haz directo de luz (fotones) que pasa a trav\u00e9s de un monocromador (prisma) para dividirlo en varias longitudes de onda componentes (espectro). Luego, un selector de longitud de onda (rendija) transmite solo las longitudes de onda deseadas, como se muestra en la Figura 1.<\/li>
- Fot\u00f3metro<\/strong> : despu\u00e9s de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a trav\u00e9s de la soluci\u00f3n de una muestra en cubeta, el fot\u00f3metro detecta la cantidad de fotones que se absorbe y luego env\u00eda una se\u00f1al a un galvan\u00f3metro o una pantalla digital, como se ilustra en la Figura 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 2: Espectrofot\u00f3metro de una sola longitud de onda<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Necesita un espectr\u00f3metro para producir una variedad de longitudes de onda porque diferentes compuestos absorben mejor en diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, el p-nitrofenol (forma \u00e1cida) tiene la absorbancia m\u00e1xima a aproximadamente 320 nm y el p-nitrofenolato (forma b\u00e1sica) absorbe mejor a 400 nm, como se muestra en la Figura 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 3: Absorbancia de dos compuestos diferentes<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Mirando el gr\u00e1fico que mide la absorbancia y la longitud de onda, tambi\u00e9n se puede observar un punto isosb\u00e9stico. Un punto isosb\u00e9stico<\/strong> es la longitud de onda en la que la absorbancia de dos o m\u00e1s especies es la misma. La aparici\u00f3n de un punto isosb\u00e9stico en una reacci\u00f3n demuestra que NO se requiere un intermedio para formar un producto a partir de un reactivo. La figura 4 muestra un ejemplo de un punto isosb\u00e9stico.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 4: Un ejemplo de punto isosb\u00e9stico (CC BY-4.0; Heesung Shim a trav\u00e9s de LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Volviendo a la Figura 1 (y la Figura 5), la cantidad de fotones que atraviesan la cubeta y llegan al detector depende de la longitud de la cubeta y de la concentraci\u00f3n de la muestra. Una vez que conoce la intensidad de la luz despu\u00e9s de que pasa a trav\u00e9s de la cubeta, puede relacionarla con la transmitancia (T). La transmitancia es la fracci\u00f3n de luz que atraviesa la muestra. Esto se puede calcular usando la ecuaci\u00f3n:<\/p>\n\n
\\(Transmitancia (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
Donde I t<\/sub> es la intensidad de la luz despu\u00e9s de que el haz de luz pasa a trav\u00e9s de la cubeta e I o<\/sub> es la intensidad de la luz antes de que el haz de luz pase a trav\u00e9s de la cubeta. La transmitancia est\u00e1 relacionada con la absorci\u00f3n por la expresi\u00f3n:<\/p>\n\n
\\(Absorbancia (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
Donde la absorbancia representa la cantidad de fotones que se absorben. Con la cantidad de absorbancia conocida de la ecuaci\u00f3n anterior, puede determinar la concentraci\u00f3n desconocida de la muestra utilizando la Ley de Beer-Lambert. La Figura 5 ilustra la transmitancia de la luz a trav\u00e9s de una muestra. La longitud \\(l\\) se utiliza para la Ley de Beer-Lambert que se describe a continuaci\u00f3n.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figura 5: Transmitancia (CC BY-4.0; Heesung Shim a trav\u00e9s de LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Ley de Beer-Lambert<\/h2>\n\n
La Ley de Beer-Lambert<\/a> (tambi\u00e9n conocida como Ley de Beer) establece que existe una relaci\u00f3n lineal entre la absorbancia y la concentraci\u00f3n de una muestra. Por esta raz\u00f3n, la Ley de Beer solo<\/em> se puede aplicar cuando existe una relaci\u00f3n lineal. La ley de Beer se escribe como:<\/p>\n\n
\\(A = \\epsilon{lc} \\)<\/p>\n\n
donde<\/p>\n\n
- \\(A\\) es la medida de absorbancia (sin unidades),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) es el coeficiente de extinci\u00f3n molar o la absortividad molar (o coeficiente de absorci\u00f3n),<\/li>
- \\(l\\) es la longitud del camino, y<\/li>
- \\(c\\) es la concentraci\u00f3n.<\/li><\/ul>\n
El coeficiente de extinci\u00f3n molar se da como una constante y var\u00eda para cada mol\u00e9cula. Dado que la absorbancia no tiene unidades, las unidades de \\(\\epsilon\\) deben cancelar las unidades de longitud y concentraci\u00f3n. Como resultado, \\(\\epsilon\\) tiene las unidades: L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . La longitud del camino se mide en cent\u00edmetros. Debido a que un espectr\u00f3metro est\u00e1ndar usa una cubeta de 1 cm de ancho, siempre se supone que \\(l\\) es igual a 1 cm. Dado que se conocen la absorci\u00f3n, \\(\\epsilon\\) y la longitud del camino, podemos calcular la concentraci\u00f3n \\(c\\) de la muestra.<\/p>\n\n
Ejemplo 1<\/strong><\/p>\n\n
La guanosina<\/a> tiene una absorbancia m\u00e1xima de 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) y la longitud del camino es de 1 cm. Usando un espectrofot\u00f3metro, encuentras que \\(A_{275} = 0,70\\). \u00bfCu\u00e1l es la concentraci\u00f3n de guanosina?<\/p>\n\n
Soluci\u00f3n<\/strong><\/p>\n\n
Para resolver este problema, debes usar la Ley de Beer.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0.70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Luego, divida ambos lados entre [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8.33×10 -5<\/sup> mol\/L<\/p>\n\n
Ejemplo 2<\/strong><\/p>\n\n
Hay una sustancia en una soluci\u00f3n (4 g\/litro). La longitud de la cubeta es de 2 cm y solo se transmite el 50% del haz de luz determinado. \u00bfQu\u00e9 es el coeficiente de absorci\u00f3n?<\/p>\n\n
Soluci\u00f3n<\/strong><\/p>\n\n
Usando la Ley de Beer-Lambert, podemos calcular el coeficiente de absorci\u00f3n. Por lo tanto,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\left(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \\\u00e9psilon\\)<\/p>\n\n
Entonces obtenemos que<\/p>\n\n
\\(\\\u00e9psilon\\) = 0.0376<\/p>\n\n
Ejemplo 3<\/strong><\/p>\n\n
En el ejemplo 2 anterior, \u00bfcu\u00e1nto es el haz de luz que se transmite cuando 8 g\/litro?<\/p>\n\n
Soluci\u00f3n<\/strong><\/p>\n\n
Como conocemos \\(\\epsilon\\), podemos calcular la transmisi\u00f3n usando la Ley de Beer-Lambert. Por lo tanto,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0.6016<\/p>\n\n
Por lo tanto, \\(I_t\\) = 0.2503 = 25%<\/p>\n\n
Ejemplo 4<\/strong><\/p>\n\n
En el ejemplo 2 anterior, \u00bfcu\u00e1l es el coeficiente de absorci\u00f3n molar si el peso molecular es 100?<\/p>\n\n
Soluci\u00f3n<\/strong><\/p>\n\n
Se puede obtener simplemente multiplicando el coeficiente de absorci\u00f3n por el peso molecular. Por lo tanto,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Ejemplo 5<\/strong><\/p>\n\n
El coeficiente de absorci\u00f3n de un complejo de gluc\u00f3geno-yodo es de 0,20 a una luz de 450 nm. \u00bfCu\u00e1l es la concentraci\u00f3n cuando la transmisi\u00f3n es del 40 % en una cubeta de 2 cm?<\/p>\n\n
Soluci\u00f3n<\/strong><\/p>\n\n
Tambi\u00e9n se puede resolver usando la Ley de Beer-Lambert. Por lo tanto,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0.4) = 0.20 \\times c \\times 2\\]<\/p>\n\n
Entonces \\(c\\) = 0.9948<\/p>\n\n
Referencias<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter y Julio de Paula. Qu\u00edmica F\u00edsica para las Ciencias de la Vida. Nueva York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Qu\u00edmica F\u00edsica para las Biociencias. EE. UU.: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gor, Michael. Espectrofotometr\u00eda y Espectrofluorimetr\u00eda. Nueva York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas y Dwek, Raymond y Wormald, Mark. Principios y Problemas de Qu\u00edmica F\u00edsica para Bioqu\u00edmicos. RG Ratcliffe. Nueva York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, C\u00e1lculos bioqu\u00edmicos (C\u00f3mo resolver problemas matem\u00e1ticos en bioqu\u00edmica general), 2.\u00aa edici\u00f3n, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Contribuidores y Atribuciones<\/h2>\n\n
- Fot\u00f3metro<\/strong> : despu\u00e9s de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a trav\u00e9s de la soluci\u00f3n de una muestra en cubeta, el fot\u00f3metro detecta la cantidad de fotones que se absorbe y luego env\u00eda una se\u00f1al a un galvan\u00f3metro o una pantalla digital, como se ilustra en la Figura 1.<\/li><\/ul>\n