Η φασματοφωτομετρία είναι μια μέθοδος για τη μέτρηση του πόσο μια χημική ουσία απορροφά το φως μετρώντας την ένταση του φωτός καθώς μια δέσμη φωτός διέρχεται από το διάλυμα δείγματος. Η βασική αρχή είναι ότι κάθε ένωση απορροφά ή μεταδίδει φως σε ένα συγκεκριμένο εύρος μήκους κύματος. Αυτή η μέτρηση μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της ποσότητας μιας γνωστής χημικής ουσίας. Η φασματοφωτομετρία είναι μια από τις πιο χρήσιμες μεθόδους ποσοτικής ανάλυσης σε διάφορους τομείς όπως η χημεία, η φυσική, η βιοχημεία, η μηχανική υλικών και η χημική μηχανική και οι κλινικές εφαρμογές.

Εισαγωγή

Κάθε χημική ένωση απορροφά, μεταδίδει ή ανακλά το φως (ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία) σε ένα συγκεκριμένο εύρος μήκους κύματος. Η φασματοφωτομετρία είναι μια μέτρηση του πόσο μια χημική ουσία απορροφά ή μεταδίδει. Η φασματοφωτομετρία χρησιμοποιείται ευρέως για ποσοτική ανάλυση σε διάφορους τομείς (π.χ. χημεία, φυσική, βιολογία, βιοχημεία, μηχανική υλικών και χημικών, κλινικές εφαρμογές, βιομηχανικές εφαρμογές κ.λπ.). Κάθε εφαρμογή που ασχολείται με χημικές ουσίες ή υλικά μπορεί να χρησιμοποιήσει αυτήν την τεχνική. Στη βιοχημεία, για παράδειγμα, χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντιδράσεων που καταλύονται από ένζυμα. Σε κλινικές εφαρμογές, χρησιμοποιείται για την εξέταση αίματος ή ιστών για κλινική διάγνωση. Υπάρχουν επίσης διάφορες παραλλαγές της φασματοφωτομετρίας, όπως η φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης και η φασματοφωτομετρία ατομικής εκπομπής.

Το φασματοφωτόμετρο είναι ένα όργανο που μετρά την ποσότητα των φωτονίων (την ένταση του φωτός) που απορροφάται αφού περάσει από το διάλυμα του δείγματος. Με το φασματοφωτόμετρο, η ποσότητα μιας γνωστής χημικής ουσίας (συγκεντρώσεις) μπορεί επίσης να προσδιοριστεί μετρώντας την ένταση του φωτός που ανιχνεύεται. Ανάλογα με το εύρος του μήκους κύματος της πηγής φωτός, μπορεί να ταξινομηθεί σε δύο διαφορετικούς τύπους:

• Φασματοφωτόμετρο ορατού υπεριώδους ακτινοβολίας : χρησιμοποιεί φως στην περιοχή υπεριώδους (185 – 400 nm) και στην ορατή περιοχή (400 – 700 nm) του φάσματος ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας.
• Φασματοφωτόμετρο υπερύθρων : χρησιμοποιεί φως στην υπέρυθρη περιοχή (700 – 15000 nm) του φάσματος ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας.

Στην ορατή φασματοφωτομετρία, η απορρόφηση ή η μετάδοση μιας συγκεκριμένης ουσίας μπορεί να προσδιοριστεί από το παρατηρούμενο χρώμα. Για παράδειγμα, ένα δείγμα διαλύματος που απορροφά φως σε όλα τα ορατά εύρη (δηλαδή, δεν μεταδίδει κανένα από τα ορατά μήκη κύματος) φαίνεται θεωρητικά μαύρο. Από την άλλη πλευρά, εάν όλα τα ορατά μήκη κύματος μεταδίδονται (δηλ. δεν απορροφά τίποτα), το δείγμα του διαλύματος εμφανίζεται λευκό. Εάν ένα δείγμα διαλύματος απορροφά κόκκινο φως (~700 nm), εμφανίζεται πράσινο επειδή το πράσινο είναι το συμπληρωματικό χρώμα του κόκκινου. Τα ορατά φασματοφωτόμετρα, στην πράξη, χρησιμοποιούν ένα πρίσμα για να περιορίσουν ένα συγκεκριμένο εύρος μήκους κύματος (για να φιλτράρουν άλλα μήκη κύματος) έτσι ώστε η συγκεκριμένη δέσμη φωτός να περάσει μέσα από ένα δείγμα διαλύματος.

Συσκευές και μηχανισμός

Το σχήμα 1 απεικονίζει τη βασική δομή των φασματοφωτομέτρων. Αποτελείται από μια πηγή φωτός, έναν ρυθμιστή, έναν μονοχρωμάτορα, έναν επιλογέα μήκους κύματος, μια κυψελίδα για διάλυμα δείγματος, έναν φωτοηλεκτρικό ανιχνευτή και μια ψηφιακή οθόνη ή έναν μετρητή. Λεπτομερής μηχανισμός περιγράφεται παρακάτω. Το σχήμα 2 δείχνει ένα δείγμα φασματοφωτόμετρου (Μοντέλο: Spectronic 20D).

Ένα φασματοφωτόμετρο, γενικά, αποτελείται από δύο συσκευές. ένα φασματόμετρο και ένα φωτόμετρο. Το φασματόμετρο είναι μια συσκευή που παράγει, συνήθως διαχέει και μετρά φως. Ένα φωτόμετρο υποδεικνύει τον φωτοηλεκτρικό ανιχνευτή που μετρά την ένταση του φωτός.

• Φασματόμετρο : Παράγει ένα επιθυμητό εύρος μήκους κύματος φωτός. Πρώτον, ένας παραμετροποιητής (φακός) μεταδίδει μια ευθεία δέσμη φωτός (φωτόνια) που διέρχεται από ένα μονοχρωμάτορα (πρίσμα) για να τον χωρίσει σε διάφορα μήκη κύματος (φάσμα). Στη συνέχεια, ένας επιλογέας μήκους κύματος (σχισμή) μεταδίδει μόνο τα επιθυμητά μήκη κύματος, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.
• Φωτόμετρο : Αφού το επιθυμητό εύρος μήκους κύματος φωτός περάσει μέσα από το διάλυμα ενός δείγματος σε κυψελίδα, το φωτόμετρο ανιχνεύει την ποσότητα των φωτονίων που απορροφάται και στη συνέχεια στέλνει ένα σήμα σε ένα γαλβανόμετρο ή μια ψηφιακή οθόνη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Χρειάζεστε ένα φασματόμετρο για να παράγει μια ποικιλία μηκών κύματος, επειδή διαφορετικές ενώσεις απορροφούν καλύτερα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Για παράδειγμα, η ρ-νιτροφαινόλη (όξινη μορφή) έχει τη μέγιστη απορρόφηση στα 320 nm περίπου και η π-νιτροφαινολική (βασική μορφή) απορροφάται καλύτερα στα 400 nm, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.

Κοιτάζοντας το γράφημα που μετρά την απορρόφηση και το μήκος κύματος, μπορεί επίσης να παρατηρηθεί ένα ισοσβεστικό σημείο. Ισοσβητικό σημείο είναι το μήκος κύματος στο οποίο η απορρόφηση δύο ή περισσότερων ειδών είναι ίδια. Η εμφάνιση ενός ισοσβεστικού σημείου σε μια αντίδραση δείχνει ότι ένα ενδιάμεσο ΔΕΝ απαιτείται για να σχηματιστεί ένα προϊόν από ένα αντιδρών. Το σχήμα 4 δείχνει ένα παράδειγμα ισοσβεστικού σημείου.

Αναφερόμενοι στο Σχήμα 1 (και στο Σχήμα 5), η ποσότητα των φωτονίων που διέρχεται από την κυψελίδα και εισέρχεται στον ανιχνευτή εξαρτάται από το μήκος της κυψελίδας και τη συγκέντρωση του δείγματος. Μόλις γνωρίζετε την ένταση του φωτός αφού περάσει από την κυψελίδα, μπορείτε να τη συσχετίσετε με τη διαπερατότητα (T). Διαπερατότητα είναι το κλάσμα του φωτός που διέρχεται από το δείγμα. Αυτό μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την εξίσωση:

\(Μετάδοση (T) = \dfrac{I_t}{I_o} \)

Όπου I _t είναι η ένταση φωτός αφού η δέσμη φωτός περάσει μέσα από την κυψελίδα και I _o είναι η ένταση φωτός πριν η δέσμη φωτός περάσει μέσα από την κυψελίδα. Η διαπερατότητα σχετίζεται με την απορρόφηση με την έκφραση:

\(Απορρόφηση (A) = – log(T) = – log(\dfrac{I_t}{I_o} )\)

Όπου η απορρόφηση αντιπροσωπεύει την ποσότητα των φωτονίων που απορροφάται. Με την ποσότητα απορρόφησης που είναι γνωστή από την παραπάνω εξίσωση, μπορείτε να προσδιορίσετε την άγνωστη συγκέντρωση του δείγματος χρησιμοποιώντας τον νόμο Beer-Lambert. Το σχήμα 5 απεικονίζει τη μετάδοση του φωτός μέσω ενός δείγματος. Το μήκος \(l\) χρησιμοποιείται για τον νόμο Beer-Lambert που περιγράφεται παρακάτω.

Νόμος Beer-Lambert

Ο νόμος Beer-Lambert (γνωστός και ως νόμος της μπύρας) δηλώνει ότι υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της απορρόφησης και της συγκέντρωσης ενός δείγματος. Για το λόγο αυτό, ο νόμος του Beer μπορεί να εφαρμοστεί μόνο όταν υπάρχει γραμμική σχέση. Ο νόμος της μπύρας γράφεται ως:

\(Α = \έψιλον{lc} \)

όπου

• Το \(A\) είναι το μέτρο απορρόφησης (χωρίς μονάδες),
• Το \(\epsilon\) είναι ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης ή η μοριακή απορρόφηση (ή ο συντελεστής απορρόφησης),
• \(l\) είναι το μήκος διαδρομής, και
• \(c\) είναι η συγκέντρωση.

Ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης δίνεται ως σταθερά και ποικίλλει για κάθε μόριο. Εφόσον η απορρόφηση δεν φέρει καμία μονάδα, οι μονάδες για το \(\epsilon\) πρέπει να ακυρώσουν τις μονάδες μήκους και συγκέντρωσης. Ως αποτέλεσμα, το \(\epsilon\) έχει τις μονάδες: L·mol ^-1 ·cm ^-1 . Το μήκος της διαδρομής μετριέται σε εκατοστά. Επειδή ένα τυπικό φασματόμετρο χρησιμοποιεί μια κυψελίδα πλάτους 1 cm, το \(l\) θεωρείται πάντα ίσο με 1 cm. Εφόσον η απορρόφηση, το \(\epsilon\) και το μήκος διαδρομής είναι γνωστά, μπορούμε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση \(c\) του δείγματος.

Παράδειγμα 1

Η γουανοσίνη έχει μέγιστη απορρόφηση 275 nm. \(\έψιλο_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \) και το μήκος διαδρομής είναι 1 cm. Χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο, βρίσκετε ότι \(A_{275} = 0,70\). Ποια είναι η συγκέντρωση της γουανοσίνης;

Λύση

Για να λύσετε αυτό το πρόβλημα, πρέπει να χρησιμοποιήσετε τον νόμο της μπύρας.

\[A lc />

0,70 = (8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)(\(c\))

Στη συνέχεια, διαιρέστε και τις δύο πλευρές με το [(8400 M ^-1 cm ^-1 )(1 cm)]

\(c\) = 8,33×10 ^-5 mol/L

Παράδειγμα 2

Υπάρχει μια ουσία σε ένα διάλυμα (4 g/λίτρο). Το μήκος της κυψελίδας είναι 2 cm και μόνο το 50% της συγκεκριμένης δέσμης φωτός μεταδίδεται. Ποιος είναι ο συντελεστής απορρόφησης;

Λύση

Χρησιμοποιώντας τον νόμο Beer-Lambert, μπορούμε να υπολογίσουμε τον συντελεστή απορρόφησης. Ετσι,

\(- \log \left(\dfrac{I_t}{I_o} \right) = – \log(\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \έψιλο\)

Τότε το παίρνουμε

\(\epsilon\) = 0,0376

Παράδειγμα 3

Στο παράδειγμα 2 παραπάνω, πόσο είναι η δέσμη φωτός που μεταδίδεται όταν 8 g/λίτρο;

Λύση

Εφόσον γνωρίζουμε το \(\epsilon\), μπορούμε να υπολογίσουμε τη μετάδοση χρησιμοποιώντας τον νόμο Beer-Lambert. Ετσι,

\(\log(1) – \log(I_t) = 0 – \log(I_t)\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016

\(\log(I_t)\) = -0,6016

Επομένως, \(I_t\) = 0,2503 = 25%

Παράδειγμα 4

Στο παράδειγμα 2 παραπάνω, ποιος είναι ο μοριακός συντελεστής απορρόφησης εάν το μοριακό βάρος είναι 100;

Λύση

Μπορεί απλά να ληφθεί πολλαπλασιάζοντας τον συντελεστή απορρόφησης με το μοριακό βάρος. Ετσι,

\(\epsilon\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L·mol ^–1 ·cm ^–1

Παράδειγμα 5

Ο συντελεστής απορρόφησης ενός συμπλόκου γλυκογόνου-ιωδίου είναι 0,20 σε φως 450 nm. Ποια είναι η συγκέντρωση όταν η μετάδοση είναι 40 % σε μια κυψελίδα 2 cm;

Λύση

Μπορεί επίσης να λυθεί χρησιμοποιώντας τον νόμο Beer-Lambert. Ως εκ τούτου,

\[- \log(I_t) = – \log(0,4) = 0,20 \ φορές c \ φορές 2\]

Τότε \(c\) = 0,9948

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Atkins, Peter και Julio de Paula. Φυσικοχημεία για τις Επιστήμες της Ζωής. Νέα Υόρκη: Oxford University Press, 2006.
2. Τσανγκ, Ρέιμοντ. Φυσικοχημεία για τις Βιοεπιστήμες. ΗΠΑ: University Science Books, 2005.
3. Γκορ, Μάικλ. Φασματοφωτομετρία & Φασματοφθοριμετρία. Νέα Υόρκη: Oxford University Press, 2000.
4. Price, Nicholas and Dwek, Raymond and Wormald, Mark. Αρχές και Προβλήματα Φυσικοχημείας για Βιοχημικούς. RG Ratcliffe. Νέα Υόρκη: Oxford University Press, 1997.
5. Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2nd edition, John Wiley & Sons, 1975
6. http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm

Συνεισφέροντες και Αναφορές

• Kevin Vo (UCD)

Πηγή