Συμβουλές και κόλπα για φωτομετρικές μετρήσεις
Είναι χρήσιμο να έχετε κατά νου όχι μόνο την ίδια τη διαδικασία φωτομετρικής μέτρησης, αλλά και τη διάταξη, το περιβάλλον μέτρησης και τον εξοπλισμό που χρησιμοποιείται.
Πηγή εικόνας: marodon 333/shutterstock.com
Η φωτομετρία είναι μια κοινή, εύκολα εκτελούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των ουσιών στο διάλυμα, και είναι επίσης ικανή να αξιολογήσει την καθαρότητα του δείγματος. Ωστόσο, σε περιπτώσεις όπου οι τιμές δεν έχουν προφανή νόημα ή αν διαφέρουν σημαντικά, η αντιμετώπιση προβλημάτων μπορεί να είναι περίπλοκη. Είναι επομένως χρήσιμο να εξαλειφθούν οι πιθανές πηγές σφάλματος από την αρχή και να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στα ακόλουθα στοιχεία κατά τη ρύθμιση και τη διεξαγωγή φωτομετρικών μετρήσεων.
Ρύθμιση & Περιβάλλον
Διαλυτικό μέσο
Η απορρόφηση ενός δείγματος επηρεάζεται από το pH του και την ιοντική ισχύ του διαλύτη του [1]. Συνιστώνται ρυθμιστικά διαλύματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε αλάτι και ουδέτερο ή ελαφρώς αλκαλικό pH, το οποίο αποτρέπει τις διακυμάνσεις του pH. Ταυτόχρονα, η εγγενής απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος στο μήκος κύματος που μετράται θα πρέπει να είναι χαμηλή προκειμένου να αποφευχθούν πιθανοί περιορισμοί του εύρους μέτρησης.
Διάλυση
Στην περίπτωση διαλυμάτων δειγμάτων υψηλής συγκέντρωσης, μπορεί να απαιτείται αραίωση προκειμένου να παραμείνει εντός του γραμμικού εύρους μέτρησης. Οι αραιώσεις στο εύρος 1:10 είναι ιδανικές. Δεν συνιστώνται αραιώσεις μεγαλύτερες από 1:50 λόγω του αυξανόμενου κινδύνου ανακρίβειων που εισάγονται μέσω αυτού του βήματος με πιπέτα. Κατ’ αρχήν, πρέπει να χρησιμοποιείται ένα βαθμονομημένο σύστημα από άκρες πιπέτας και πιπέτας για ακριβή και ακριβή εισαγωγή με σιφώνιο.
Μίξη
Μετά την παρασκευή των αραιώσεων, αλλά και μετά από μεγάλες περιόδους ακινησίας, ενδέχεται να προκύψουν τοπικές διαφορές συγκέντρωσης εντός του δείγματος. Επομένως, είναι σημαντικό να αναμιγνύετε καλά το διάλυμα του δείγματος πριν και μετά από κάθε στάδιο αραίωσης, καθώς και αμέσως πριν από τη μέτρηση. Τα καλύτερα αποτελέσματα επιτυγχάνονται μέσω του vortexing.
Θερμοκρασία
Το περιβάλλον και το φωτόμετρο, καθώς και οι κυψελίδες και τα δείγματα, θα πρέπει να διατηρούνται σε ίδιες θερμοκρασίες προκειμένου να αποφευχθεί η μετατόπιση των μετρούμενων τιμών.
Εξοπλισμός & Μέτρηση
Κουβέτες
Κατά την επιλογή των κυβετών, η διαφάνειά τους στα απαιτούμενα μήκη κύματος, καθώς και η συμβατότητά τους με το αντίστοιχο φωτόμετρο, είναι από τους σημαντικότερους καθοριστικούς παράγοντες. Αυτό περιλαμβάνει, για παράδειγμα, τον συντονισμό των υψών των μονοπατιών φωτός και τη διασφάλιση ότι οι κυψελίδες γεμίζουν με επαρκείς όγκους δειγμάτων. Για να ληφθούν ακριβή αποτελέσματα, το τυφλό, καθώς και τα δείγματα, θα πρέπει να μετρηθούν στην ίδια κυψελίδα, με την κυψελίδα να βρίσκεται πάντα στον ίδιο προσανατολισμό στον άξονα της κυβέτας.
Μέτρηση
Πριν από τη μέτρηση, πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός φυσαλίδων αέρα μέσα στην κυψελίδα που θα μπορούσαν να διακόψουν τη διαδρομή του φωτός (αυτό ισχύει τόσο για το τυφλό όσο και για τα δείγματα). Οι ρυθμίσεις φωτομέτρου πρέπει να είναι κατάλληλες για τη μέθοδο, το δείγμα και τις κυψελίδες που έχουν επιλεγεί. Μετά τη μέτρηση, όλα τα αποτελέσματα θα πρέπει να ελέγχονται για αληθοφάνεια.
Βιβλιογραφικές αναφορές:
[1] Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P. Επίδραση του pH και της ιοντικής ισχύος στη φασματοφωτομετρική εκτίμηση της καθαρότητας νουκλεϊκού οξέος. BioTechniques 1997; 22:474–481.