Στο πλαίσιο των μοριακών και βιοχημικών εφαρμογών, καθώς και στην ιατρική διαγνωστική, ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των ουσιών στο διάλυμα είναι ένα κρίσιμο βήμα ανάλυσης. Συχνά, χρησιμοποιούνται φωτομετρικές μέθοδοι για το σκοπό αυτό, καθώς αυτές μπορούν να διεξαχθούν εύκολα και γρήγορα και επειδή συχνά αντιπροσωπεύουν την πιο οικονομική επιλογή.

Γενικά, οι (φασματο)-φωτομετρικές μέθοδοι βασίζονται στην αρχή ότι τα μόρια στο διάλυμα απορροφούν φως και ότι το έτσι εξασθενημένο φως μετράται με τη βοήθεια ενός ανιχνευτή. Όπως υπονοείται στο όνομα, τα φασματοφωτόμετρα UV/Vis χρησιμοποιούν ορατό και υπεριώδες φως στην περιοχή μήκους κύματος μεταξύ περίπου 200 και 900 nm.

Προκειμένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση μιας αναλυόμενης ουσίας, τις περισσότερες φορές χρησιμοποιείται το μήκος κύματος στο οποίο το μόριο εμφανίζει την υψηλότερη απορρόφηση (μήκος κύματος κορυφής). Στην περίπτωση νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών, για παράδειγμα, αυτό θα ήταν 260 nm και 280 nm, αντίστοιχα. Οι νόμοι της φυσικής που περιγράφονται από το νόμο Lambert-Beer αποτελούν τη βάση για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης μιας ουσίας από φωτομετρικές μετρήσεις. Αυτό συμβαίνει σύμφωνα με τα βήματα των τύπων που αναφέρονται παρακάτω:

1. Μετάδοση ή μετάδοση (T) = I/I ₀
   Η μετάδοση προσδιορίζεται σε ένα φωτόμετρο, χρησιμοποιώντας την αναλογία μεταξύ του φωτός που εξέρχεται και του φωτός που εισέρχεται στο δείγμα.
2. Απορρόφηση (A) = log (I ₀ /I)
   Η απορρόφηση υπολογίζεται από τον αρνητικό δεκαδικό λογάριθμο μετάδοσης.
3. Απορρόφηση (A) = C x L x Ɛ => Συγκέντρωση (C) = A/(L x Ɛ)
   Ο νόμος Lambert-Beer περιγράφει την εξάρτηση της απορρόφησης από τη συγκέντρωση του δείγματος (C), το μήκος της οπτικής διαδρομής (L) καθώς και την εξάρτηση από έναν ειδικό για δείγμα συντελεστή εξάλειψης (Ɛ), ο οποίος σχετίζεται με μια συγκεκριμένη ουσία. σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Στη συνέχεια, η συγκέντρωση του δείγματος υπολογίζεται μετατρέποντας τον τύπο.

Αυτές οι τρεις δηλώσεις περιγράφονται λεπτομερέστερα παρακάτω.

Προσδιορισμός μετάδοσης (T = I/I ₀ )

Εικόνα 1: Απλοποιημένη συναρμολόγηση φωτομέτρου που απεικονίζει το δείγμα και τις παραμέτρους που σχετίζονται με το νόμο της Lambert-Beer

I ₀ : Φως που εισέρχεται στο δείγμα
I: Φως που εξέρχεται από το δείγμα
Γ: Συγκέντρωση του δείγματος
L: Διαδρομή φωτός/πάχος του δείγματος
Ɛ: Συντελεστής απόσβεσης

Βασικά, ένα φωτόμετρο αποτελείται από μια πηγή φωτός, μια θέση που συγκρατεί το δείγμα και έναν ανιχνευτή (εικόνα 1). Ο ανιχνευτής μετρά την ένταση του φωτός που διασχίζει το δείγμα. Φυσικά, υπάρχουν πολλά άλλα συστατικά. Συγκεκριμένα, οπτικά στοιχεία που διαθλούν το φως και το διαχωρίζουν σε μεμονωμένα μήκη κύματος καθώς και στοιχεία που αντανακλούν ή μεταδίδουν το φως.

Η πηγή φωτός ενός φωτομέτρου εκπέμπει φως με καθορισμένη ένταση I ₀ , η οποία καθοδηγείται μέσα από το διάλυμα του δείγματος. Ένα μέρος του φωτός θα απορροφηθεί από το δείγμα. Το τμήμα που διασχίζει το δείγμα καταγράφεται από τον ανιχνευτή ως ένταση Ι. Ο λόγος I/I ₀ περιγράφει τη μετάδοση του δείγματος σε ένα καθορισμένο μήκος κύματος.

Υπολογισμός απορρόφησης (A = log (I ₀ /I)

Τα σύγχρονα φωτόμετρα μετατρέπουν αυτόματα τη μετάδοση ενός δείγματος σε απορρόφηση, η οποία ορίζεται ως ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος μετάδοσης. Τίθεται το ερώτημα γιατί η μετάδοση δεν χρησιμοποιείται άμεσα για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του δείγματος. Το Σχήμα 2 διευκρινίζει τη σύνδεση μεταξύ μετάδοσης και απορρόφησης. Εάν πολλά δείγματα, από τα οποία το καθένα επιτρέπει το 50 % του φωτός που εισέρχεται στο δείγμα να διασχίσει, συνδεθούν σε σειρά, θα προκύψει η εκθετικά φθίνουσα καμπύλη μετάδοσης, που απεικονίζεται παρακάτω. Αν οι τιμές εκφραστούν με λογαριθμικό τρόπο, θα προκύψει μια γραμμική εξάρτηση. Με αυτόν τον τρόπο, η απορρόφηση είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση (καθώς και το μήκος διαδρομής), γεγονός που απλοποιεί σημαντικά τους υπολογισμούς.

Εικόνα 2: Η σύνδεση μεταξύ μετάδοσης και απορρόφησης φωτός:

α) Σύνδεση δειγμάτων σε σειρά, καθένα από τα οποία επιτρέπει τη μετάδοση του 50 % του φωτός που εισέρχεται στο δείγμα. Το ποσοστό αφορά την αρχική ένταση φωτός.

β) Εκθετικά φθίνουσα καμπύλη μετάδοσης

γ) Γραφική αναπαράσταση της απορρόφησης (χρησιμοποιώντας τον δεκαδικό λογάριθμο μετάδοσης)

Υπολογισμός συγκέντρωσης (C = A/(L x Ɛ))

Για να εξαχθεί η συγκέντρωση ενός δείγματος από την απορρόφησή του, απαιτούνται πρόσθετες πληροφορίες. Ο νόμος Lambert-Beer, ο οποίος αποτελεί τη φυσική βάση για τις φωτομετρικές εφαρμογές, περιγράφει ότι η απορρόφηση του φωτός από ένα δείγμα είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωσή του και το μήκος της διαδρομής του. Συνολικά, τρεις παράμετροι συμβάλλουν στην τιμή απορρόφησης ενός δείγματος: πρώτον, η συγκέντρωση (C) του μορίου. δεύτερον, το μήκος διαδρομής (L) του δείγματος, το οποίο γενικά ισούται με το μήκος διαδρομής της κυβέτας. Έπειτα υπάρχει ο συντελεστής απόσβεσης (Ɛ). Ο συντελεστής εξαφάνισης είναι μια φυσική σταθερά μοναδική για το μόριο. περιγράφει την ιδιότητά του να απορροφά φως σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Αυτή η ειδική για το υλικό σταθερά είναι γνωστή για έναν αριθμό ουσιών, συμπεριλαμβανομένων των νουκλεϊκών οξέων και διαφόρων πρωτεϊνών, και οι τιμές έχουν δημοσιευθεί στη σχετική βιβλιογραφία. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η συγκέντρωση μπορεί να προσδιοριστεί αμέσως. Εάν, ωστόσο, η τιμή δεν είναι γνωστή, μπορείτε να ζητήσετε τη βοήθεια μιας καμπύλης βαθμονόμησης. Για να δημιουργηθεί μια καμπύλη βαθμονόμησης, απαιτούνται πρότυπα, δηλαδή διαλύματα που περιέχουν γνωστές συγκεντρώσεις των προς ανάλυση ουσιών. Αυτά μετρώνται στο φωτόμετρο πριν από το πραγματικό δείγμα. Η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στη συνέχεια υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη.

Πέραν του ποσοτικού προσδιορισμού, οι μετρήσεις απορρόφησης μπορεί επίσης να αποκαλύψουν ποιοτικές πληροφορίες για το δείγμα: για παράδειγμα, η καθαρότητα των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών μπορεί να προσδιοριστεί υποβάλλοντας το δείγμα σε μετρήσεις σε επιπλέον μήκη κύματος, ενώ οι πληροφορίες για τη δραστηριότητα του ενζύμου λαμβάνονται γενικά μέσω επαναλαμβανόμενων μετρήσεων χρόνος.

Πηγή