{"id":69027,"date":"2022-02-21T12:53:04","date_gmt":"2022-02-21T04:53:04","guid":{"rendered":"https:\/\/qvarz.com\/extinktionsmessungen-der-schnelle-weg-zur-bestimmung-der-probenkonzentration-2\/"},"modified":"2022-02-21T12:53:28","modified_gmt":"2022-02-21T04:53:28","slug":"extinktionsmessungen-der-schnelle-weg-zur-bestimmung-der-probenkonzentration-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/qvarz.com\/de\/extinktionsmessungen-der-schnelle-weg-zur-bestimmung-der-probenkonzentration-2\/","title":{"rendered":"Extinktionsmessungen \u2013 der schnelle Weg zur Bestimmung der Probenkonzentration"},"content":{"rendered":"\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Bei molekularen und biochemischen Anwendungen sowie in der medizinischen Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentrationen von Substanzen in L\u00f6sung ein entscheidender Analyseschritt. H\u00e4ufig werden hierf\u00fcr photometrische Methoden eingesetzt, da diese einfach und schnell durchf\u00fchrbar sind und oft die kosteng\u00fcnstigste Option darstellen.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Im Allgemeinen beruhen (spektro-)photometrische Verfahren auf dem Prinzip, dass Molek\u00fcle in L\u00f6sung Licht absorbieren und das dadurch abgeschw\u00e4chte Licht mit Hilfe eines Detektors gemessen wird. Wie der Name schon sagt, verwenden UV\/Vis-Spektralphotometer sichtbares und ultraviolettes Licht im Wellenl\u00e4ngenbereich zwischen etwa 200 und 900 nm.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Um die Konzentration eines Analyten zu bestimmen, wird meistens die Wellenl\u00e4nge verwendet, bei der das Molek\u00fcl die h\u00f6chste Extinktion (Spitzenwellenl\u00e4nge) aufweist. Bei Nukleins\u00e4uren und Proteinen w\u00e4ren dies beispielsweise 260 nm bzw. 280 nm. Die durch das Lambert-Beer-Gesetz beschriebenen physikalischen Gesetze bilden die Grundlage f\u00fcr die Berechnung der Konzentration eines Stoffes aus photometrischen Messungen. Dies geschieht nach den Schritten der unten aufgef\u00fchrten Formeln:<\/p>\n\n<ol class=\"wp-block-list\"><li>Transmission oder Transmission (T) = I\/I <sub>0<\/sub><br\/>Die Transmission wird in einem Photometer bestimmt, indem das Verh\u00e4ltnis zwischen dem austretenden und dem in die Probe eintretenden Licht verwendet wird.<\/li><li>Extinktion (A) = log (I <sub>0<\/sub> \/I)<br\/>Die Extinktion wird aus dem negativen dekadischen Logarithmus der Transmission berechnet.<\/li><li>Extinktion (A) = C x L x \u0190 =&gt; Konzentration (C) = A\/(L x \u0190)<br\/>Das Lambert-Beer-Gesetz beschreibt die Abh\u00e4ngigkeit der Extinktion von der Konzentration der Probe (C), der optischen Wegl\u00e4nge (L) sowie die Abh\u00e4ngigkeit von einem probenspezifischen Extinktionskoeffizienten (\u0190), der zu einer bestimmten Substanz geh\u00f6rt bei einer bestimmten Wellenl\u00e4nge. Die Probenkonzentration wird dann durch Umrechnung der Formel berechnet.<\/li><\/ol>\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Diese drei Aussagen werden im Folgenden n\u00e4her beschrieben.<br\/><br\/><strong>Transmissionsbestimmung (T = I\/I <sub>0<\/sub> )<\/strong><\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><a href=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1.jpg\"><img fetchpriority=\"high\" decoding=\"async\" width=\"350\" height=\"229\" src=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-67852\" title=\"\" srcset=\"https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1.jpg 350w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1-83x54.jpg 83w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1-64x42.jpg 64w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-1-300x196.jpg 300w\" sizes=\"(max-width: 350px) 100vw, 350px\" \/><\/a><\/figure><\/div>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Abbildung 1: Vereinfachter Aufbau eines Photometers mit Darstellung der Probe und Parameter, die f\u00fcr das Lambert-Beer-Gesetz relevant sind<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><em>I <sub>0<\/sub> : Licht, das in die Probe eindringt<br\/>I: Licht, das die Probe verl\u00e4sst<br\/>C: Konzentration der Probe<br\/>L: Lichtweg\/Dicke der Probe<br\/>\u0190: Extinktionskoeffizient<\/em><\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Grunds\u00e4tzlich besteht ein Photometer aus einer Lichtquelle, einer Position, die die Probe h\u00e4lt, und einem Detektor (Abbildung 1). Der Detektor misst die Intensit\u00e4t des Lichts, das durch die Probe wandert. Nat\u00fcrlich sind eine Reihe anderer Komponenten vorhanden; insbesondere optische Elemente, die das Licht brechen und in einzelne Wellenl\u00e4ngen zerlegen sowie Elemente, die das Licht reflektieren oder durchlassen.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Die Lichtquelle eines Photometers sendet Licht mit definierter Intensit\u00e4t I <sub>0<\/sub> aus, das durch die Probenl\u00f6sung geleitet wird. Ein Teil des Lichts wird von der Probe absorbiert. Der Anteil, der die Probe durchdringt, wird vom Detektor als Intensit\u00e4t I registriert. Das Verh\u00e4ltnis I\/I <sub>0<\/sub> beschreibt die Transmission der Probe bei einer definierten Wellenl\u00e4nge.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>Berechnung der Extinktion (A = log (I <sub>0<\/sub> \/I)<\/strong><\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Moderne Photometer wandeln die Transmission einer Probe automatisch in Extinktion um, die als negativer dekadischer Logarithmus der Transmission definiert ist. Es stellt sich die Frage, warum die Transmission nicht direkt zur Berechnung der Probenkonzentration herangezogen wird. Abbildung 2 verdeutlicht den Zusammenhang zwischen Transmission und Absorption. Werden mehrere Proben, die jeweils 50 % des einfallenden Lichts passieren lassen, hintereinander geschaltet, ergibt sich die unten abgebildete, exponentiell abfallende Transmissionskurve. Wenn die Werte stattdessen logarithmisch ausgedr\u00fcckt werden, ergibt sich eine lineare Abh\u00e4ngigkeit. Auf diese Weise ist die Extinktion proportional zur Konzentration (sowie zur Wegl\u00e4nge), was die Berechnungen erheblich vereinfacht.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>Abbildung 2: Der Zusammenhang zwischen Transmission und Absorption von Licht:<\/strong><\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><a href=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2.jpg\"><img decoding=\"async\" width=\"474\" height=\"75\" src=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-67866\" title=\"\" srcset=\"https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2.jpg 474w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2-90x14.jpg 90w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2-64x10.jpg 64w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-2-300x47.jpg 300w\" sizes=\"(max-width: 474px) 100vw, 474px\" \/><\/a><\/figure><\/div>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">a) Hintereinanderschalten von Proben, die jeweils 50 % des in die Probe einfallenden Lichts durchlassen. Der Prozentsatz bezieht sich auf die anf\u00e4ngliche Lichtintensit\u00e4t.<\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><a href=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3.jpg\"><img decoding=\"async\" width=\"588\" height=\"275\" src=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-67880\" title=\"\" srcset=\"https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3.jpg 588w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3-90x42.jpg 90w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3-64x30.jpg 64w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-3-300x140.jpg 300w\" sizes=\"(max-width: 588px) 100vw, 588px\" \/><\/a><\/figure><\/div>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">b) Exponentiell abfallende Transmissionskurve<\/p>\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-large\"><a href=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4.jpg\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"588\" height=\"275\" src=\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-67894\" title=\"\" srcset=\"https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4.jpg 588w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4-90x42.jpg 90w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4-64x30.jpg 64w, https:\/\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/Absorbance-Measurements-4-300x140.jpg 300w\" sizes=\"(max-width: 588px) 100vw, 588px\" \/><\/a><\/figure><\/div>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">c) Grafische Darstellung der Extinktion (unter Verwendung des dekadischen Logarithmus der Transmission)<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong><u>Konzentrationsberechnung (C = A\/(L x \u0190))<\/u><\/strong><br\/><br\/>Um die Konzentration einer Probe aus ihrer Extinktion abzuleiten, sind zus\u00e4tzliche Informationen erforderlich. Das Lambert-Beer-Gesetz, das die physikalische Grundlage f\u00fcr photometrische Anwendungen bildet, beschreibt, dass die Absorption von Licht durch eine Probe direkt proportional zu ihrer Konzentration und ihrer Wegl\u00e4nge ist. Insgesamt tragen drei Parameter zum Extinktionswert einer Probe bei: erstens die Konzentration (C) des Molek\u00fcls; Zweitens die Wegl\u00e4nge (L) der Probe, die im Allgemeinen gleich der Wegl\u00e4nge der K\u00fcvette ist. Dann gibt es noch den Extinktionskoeffizienten (\u0190). Der Extinktionskoeffizient ist eine f\u00fcr das Molek\u00fcl einzigartige physikalische Konstante; es beschreibt seine Eigenschaft, Licht bei einer bestimmten Wellenl\u00e4nge zu absorbieren. Diese materialspezifische Konstante ist f\u00fcr eine Reihe von Substanzen, darunter Nukleins\u00e4uren und verschiedene Proteine, bekannt und die Werte in der einschl\u00e4gigen Literatur ver\u00f6ffentlicht. In diesen F\u00e4llen kann die Konzentration sofort bestimmt werden. Ist der Wert jedoch nicht bekannt, kann eine Kalibrierkurve zu Hilfe genommen werden. Zur Erstellung einer Kalibrierkurve werden Standards ben\u00f6tigt, dh L\u00f6sungen, die bekannte Konzentrationen der zu analysierenden Substanzen enthalten. Diese werden im Photometer vor der eigentlichen Probe gemessen. Die Konzentration des Analyten wird dann unter Verwendung der Standardkurve berechnet.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Neben der Quantifizierung k\u00f6nnen Extinktionsmessungen auch qualitative Informationen \u00fcber die Probe liefern: Beispielsweise kann die Reinheit von Nukleins\u00e4uren und Proteinen bestimmt werden, indem die Probe Messungen bei zus\u00e4tzlichen Wellenl\u00e4ngen unterzogen wird, w\u00e4hrend Informationen \u00fcber die Enzymaktivit\u00e4t im Allgemeinen durch wiederholte Messungen gewonnen werden Zeit.<\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><a href=\"https:\/\/handling-solutions.eppendorf.com\/sample-handling\/photometry\/principles\/detailview-principles\/news\/absorbance-measurements-the-quick-way-to-determine-sample-concentration\/\" target=\"_blank\" rel=\"noopener\">Quelle<\/a><\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><\/p>\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Bei molekularen und biochemischen Anwendungen sowie in der medizinischen Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentrationen von Substanzen in L\u00f6sung ein entscheidender Analyseschritt. 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