Bei der sichtbaren Spektrophotometrie kann die Absorption oder die Transmission einer bestimmten Substanz anhand der beobachteten Farbe bestimmt werden. Zum Beispiel erscheint eine L\u00f6sungsprobe, die Licht \u00fcber alle sichtbaren Bereiche absorbiert (dh keine sichtbaren Wellenl\u00e4ngen durchl\u00e4sst), theoretisch schwarz. Wenn andererseits alle sichtbaren Wellenl\u00e4ngen durchgelassen werden (dh nichts absorbiert wird), erscheint die L\u00f6sungsprobe wei\u00df. Wenn eine L\u00f6sungsprobe rotes Licht (~700 nm) absorbiert, erscheint sie gr\u00fcn, da Gr\u00fcn die Komplement\u00e4rfarbe von Rot ist. Sichtbare Spektralphotometer verwenden in der Praxis ein Prisma, um einen bestimmten Wellenl\u00e4ngenbereich einzugrenzen (um andere Wellenl\u00e4ngen herauszufiltern), so dass der bestimmte Lichtstrahl durch eine L\u00f6sungsprobe geleitet wird.<\/p>\n\n
Ger\u00e4te und Mechanismus<\/h2>\n\n
Abbildung 1 veranschaulicht den grundlegenden Aufbau von Spektralfotometern. Es besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator, einem Monochromator, einem Wellenl\u00e4ngenw\u00e4hler, einer K\u00fcvette f\u00fcr die Probenl\u00f6sung, einem photoelektrischen Detektor und einer digitalen Anzeige oder einem Messger\u00e4t. Der detaillierte Mechanismus wird unten beschrieben. Abbildung 2 zeigt ein beispielhaftes Spektrophotometer (Modell: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Ein Spektralfotometer besteht im Allgemeinen aus zwei Ger\u00e4ten; ein Spektrometer und ein Photometer. Ein Spektrometer ist ein Ger\u00e4t, das Licht erzeugt, typischerweise zerstreut und misst. Ein Photometer bezeichnet den photoelektrischen Detektor, der die Lichtintensit\u00e4t misst.<\/p>\n\n
- Spektrometer<\/strong> : Es erzeugt einen gew\u00fcnschten Wellenl\u00e4ngenbereich des Lichts. Zuerst \u00fcbertr\u00e4gt ein Kollimator (Linse) einen geraden Lichtstrahl (Photonen), der durch einen Monochromator (Prisma) geht, um ihn in mehrere Komponentenwellenl\u00e4ngen (Spektrum) aufzuteilen. Dann l\u00e4sst ein Wellenl\u00e4ngenselektor (Schlitz) nur die gew\u00fcnschten Wellenl\u00e4ngen durch, wie in Abbildung 1 gezeigt.<\/li>
- Photometer<\/strong> : Nachdem der gew\u00fcnschte Wellenl\u00e4ngenbereich des Lichts die L\u00f6sung einer Probe in der K\u00fcvette passiert hat, erkennt das Photometer die Menge der absorbierten Photonen und sendet dann ein Signal an ein Galvanometer oder eine Digitalanzeige, wie in Abbildung 1 dargestellt.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Abbildung 2: Ein Spektralphotometer mit einer Wellenl\u00e4nge<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Sie ben\u00f6tigen ein Spektrometer, um eine Vielzahl von Wellenl\u00e4ngen zu erzeugen, da verschiedene Verbindungen bei unterschiedlichen Wellenl\u00e4ngen am besten absorbieren. Beispielsweise hat p-Nitrophenol (S\u00e4ureform) die maximale Absorption bei etwa 320 nm und p-Nitrophenolat (basische Form) absorbiert am besten bei 400 nm, wie in Abbildung 3 gezeigt.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Abbildung 3: Absorption von zwei verschiedenen Verbindungen<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Betrachtet man das Diagramm, das Absorption und Wellenl\u00e4nge misst, kann auch ein isosbestischer Punkt beobachtet werden. Ein isosbestischer Punkt<\/strong> ist die Wellenl\u00e4nge, bei der die Extinktion von zwei oder mehr Spezies gleich ist. Das Auftreten eines isosbestischen Punktes in einer Reaktion zeigt, dass ein Zwischenprodukt NICHT erforderlich ist, um aus einem Reaktanten ein Produkt zu bilden. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel f\u00fcr einen isosbestischen Punkt.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Abbildung 4: Ein Beispiel f\u00fcr einen isosbestischen Punkt (CC BY-4.0; Heesung Shim \u00fcber LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Unter erneuter Bezugnahme auf Abbildung 1 (und Abbildung 5) h\u00e4ngt die Menge an Photonen, die durch die K\u00fcvette und in den Detektor gelangt, von der L\u00e4nge der K\u00fcvette und der Konzentration der Probe ab. Sobald Sie die Intensit\u00e4t des Lichts kennen, nachdem es die K\u00fcvette passiert hat, k\u00f6nnen Sie es mit der Transmission (T) in Beziehung setzen. Transmission ist der Lichtanteil, der durch die Probe hindurchgeht. Dies kann mit der Gleichung berechnet werden:<\/p>\n\n
\\(Transmission (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
Wobei I t<\/sub> die Lichtintensit\u00e4t ist, nachdem der Lichtstrahl die K\u00fcvette passiert hat, und I o<\/sub> die Lichtintensit\u00e4t ist, bevor der Lichtstrahl die K\u00fcvette passiert hat. Die Durchl\u00e4ssigkeit steht in Beziehung zur Absorption durch den Ausdruck:<\/p>\n\n
\\(Extinktion (A) = -log(T) = -log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
Wobei Absorption f\u00fcr die Menge an Photonen steht, die absorbiert wird. Mit der aus der obigen Gleichung bekannten Extinktionsmenge k\u00f6nnen Sie die unbekannte Konzentration der Probe mithilfe des Beer-Lambert-Gesetzes bestimmen. Fig. 5 veranschaulicht die Lichtdurchl\u00e4ssigkeit durch eine Probe. Die L\u00e4nge \\(l\\) wird f\u00fcr das unten beschriebene Beer-Lambert-Gesetz verwendet.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Abbildung 5: \u00dcbertragung (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Bier-Lambert-Gesetz<\/h2>\n\n
Das Beer-Lambert-Gesetz<\/a> (auch bekannt als Beer’s Law) besagt, dass es eine lineare Beziehung zwischen der Extinktion und der Konzentration einer Probe gibt. Aus diesem Grund kann das Beer’sche Gesetz nur<\/em> angewendet werden, wenn ein linearer Zusammenhang besteht. Das Biergesetz wird wie folgt geschrieben:<\/p>\n\n
\\(A = \u03b5{lc} \\)<\/p>\n\n
wo<\/p>\n\n
- \\(A\\) ist das Ma\u00df der Extinktion (keine Einheiten),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) ist der molare Extinktionskoeffizient oder der molare Absorptionsgrad (oder Absorptionskoeffizient),<\/li>
- \\(l\\) ist die Pfadl\u00e4nge, und<\/li>
- \\(c\\) ist die Konzentration.<\/li><\/ul>\n
Der molare Extinktionskoeffizient wird als Konstante angegeben und variiert f\u00fcr jedes Molek\u00fcl. Da die Extinktion keine Einheiten tr\u00e4gt, m\u00fcssen die Einheiten f\u00fcr \\(\\epsilon\\) die L\u00e4ngen- und Konzentrationseinheiten aufheben. Damit hat \\(\\epsilon\\) die Einheit: L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . Die Wegl\u00e4nge wird in Zentimetern gemessen. Da ein Standardspektrometer eine 1 cm breite K\u00fcvette verwendet, wird \\(l\\) immer gleich 1 cm angenommen. Da Absorption, \\(\\epsilon\\) und Wegl\u00e4nge bekannt sind, k\u00f6nnen wir die Konzentration \\(c\\) der Probe berechnen.<\/p>\n\n
Beispiel 1<\/strong><\/p>\n\n
Guanosin<\/a> hat eine maximale Extinktion von 275 nm. \\(\\Epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) und die Pfadl\u00e4nge betr\u00e4gt 1 cm. Mit einem Spektralfotometer finden Sie das \\(A_{275} = 0,70\\). Wie hoch ist die Konzentration von Guanosin?<\/p>\n\n
L\u00f6sung<\/strong><\/p>\n\n
Um dieses Problem zu l\u00f6sen, m\u00fcssen Sie das Biergesetz anwenden.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Als n\u00e4chstes teilen Sie beide Seiten durch [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8,33 x 10 -5<\/sup> mol\/l<\/p>\n\n
Beispiel 2<\/strong><\/p>\n\n
Es gibt eine Substanz in einer L\u00f6sung (4 g\/Liter). Die L\u00e4nge der K\u00fcvette betr\u00e4gt 2 cm und nur 50 % des bestimmten Lichtstrahls werden durchgelassen. Was ist der Absorptionskoeffizient?<\/p>\n\n
L\u00f6sung<\/strong><\/p>\n\n
Unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes k\u00f6nnen wir den Absorptionskoeffizienten berechnen. Daher,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\left(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0.5}{1.0}) = A ={8} \\Epsilon\\)<\/p>\n\n
Dann erhalten wir das<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Beispiel 3<\/strong><\/p>\n\n
In Beispiel 2 oben, wie viel wird der Lichtstrahl durchgelassen, wenn 8 g\/Liter ?<\/p>\n\n
L\u00f6sung<\/strong><\/p>\n\n
Da wir \\(\\epsilon\\) kennen, k\u00f6nnen wir die Transmission nach dem Beer-Lambert-Gesetz berechnen. Daher,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
Daher \\(I_t\\) = 0,2503 = 25 %<\/p>\n\n
Beispiel 4<\/strong><\/p>\n\n
Wie hoch ist in Beispiel 2 oben der molare Absorptionskoeffizient, wenn das Molekulargewicht 100 betr\u00e4gt?<\/p>\n\n
L\u00f6sung<\/strong><\/p>\n\n
Er kann einfach durch Multiplizieren des Absorptionskoeffizienten mit dem Molekulargewicht erhalten werden. Daher,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Beispiel 5<\/strong><\/p>\n\n
Der Absorptionskoeffizient eines Glykogen-Jod-Komplexes betr\u00e4gt 0,20 bei Licht von 450 nm. Wie hoch ist die Konzentration bei einer Transmission von 40 % in einer K\u00fcvette von 2 cm?<\/p>\n\n
L\u00f6sung<\/strong><\/p>\n\n
Es kann auch mit dem Beer-Lambert-Gesetz gel\u00f6st werden. Deswegen,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0,4) = 0,20 \\times c \\times 2\\]<\/p>\n\n
Dann ist \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Verweise<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter und Julio de Paula. Physikalische Chemie f\u00fcr die Lebenswissenschaften. New York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Physikalische Chemie f\u00fcr die Biowissenschaften. USA: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gore, Michael. Spektrophotometrie & Spektrofluorimetrie. New York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas und Dwek, Raymond und Wormald, Mark. Prinzipien und Probleme der Physikalischen Chemie f\u00fcr Biochemiker. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. Auflage, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Mitwirkende und Zuschreibungen<\/h2>\n\n
- Photometer<\/strong> : Nachdem der gew\u00fcnschte Wellenl\u00e4ngenbereich des Lichts die L\u00f6sung einer Probe in der K\u00fcvette passiert hat, erkennt das Photometer die Menge der absorbierten Photonen und sendet dann ein Signal an ein Galvanometer oder eine Digitalanzeige, wie in Abbildung 1 dargestellt.<\/li><\/ul>\n