Ved synlig spektrofotometri kan absorptionen eller transmissionen af et bestemt stof bestemmes af den observerede farve. For eksempel ser en opl\u00f8sningspr\u00f8ve, der absorberer lys over alle synlige omr\u00e5der (dvs. ikke transmitterer nogen af de synlige b\u00f8lgel\u00e6ngder), sort i teorien. P\u00e5 den anden side, hvis alle synlige b\u00f8lgel\u00e6ngder transmitteres (dvs. ikke absorberer noget), fremst\u00e5r opl\u00f8sningspr\u00f8ven hvid. Hvis en opl\u00f8sningspr\u00f8ve absorberer r\u00f8dt lys (~700 nm), ser den gr\u00f8n ud, fordi gr\u00f8n er komplement\u00e6rfarven til r\u00f8d. Synlige spektrofotometre bruger i praksis et prisme til at indsn\u00e6vre et bestemt b\u00f8lgel\u00e6ngdeinterval (for at filtrere andre b\u00f8lgel\u00e6ngder fra), s\u00e5 den s\u00e6rlige lysstr\u00e5le passerer gennem en opl\u00f8sningspr\u00f8ve.<\/p>\n\n
Enheder og mekanisme<\/h2>\n\n
Figur 1 illustrerer den grundl\u00e6ggende struktur af spektrofotometre. Den best\u00e5r af en lyskilde, en kollimator, en monokromator, en b\u00f8lgel\u00e6ngdev\u00e6lger, en kuvette til pr\u00f8veopl\u00f8sning, en fotoelektrisk detektor og et digitalt display eller en m\u00e5ler. Detaljeret mekanisme er beskrevet nedenfor. Figur 2 viser et pr\u00f8vespektrofotometer (model: Spectronic 20D).<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-1.png\" "\\"\\"")
<\/a>Et spektrofotometer best\u00e5r generelt af to enheder; et spektrometer og et fotometer. Et spektrometer er en enhed, der producerer, spreder og m\u00e5ler lys. Et fotometer angiver den fotoelektriske detektor, der m\u00e5ler lysets intensitet.<\/p>\n\n
- Spektrometer<\/strong> : Det producerer et \u00f8nsket b\u00f8lgel\u00e6ngdeomr\u00e5de af lys. F\u00f8rst transmitterer en kollimator (linse) en lige str\u00e5le af lys (fotoner), der passerer gennem en monokromator (prisme) for at opdele den i flere komponentb\u00f8lgel\u00e6ngder (spektrum). S\u00e5 sender en b\u00f8lgel\u00e6ngdev\u00e6lger (spalte) kun de \u00f8nskede b\u00f8lgel\u00e6ngder, som vist i figur 1.<\/li>
- Fotometer<\/strong> : Efter det \u00f8nskede lysb\u00f8lgel\u00e6ngdeomr\u00e5de er passeret gennem opl\u00f8sningen af en pr\u00f8ve i kuvette, registrerer fotometeret m\u00e6ngden af fotoner, der absorberes, og sender derefter et signal til et galvanometer eller et digitalt display, som illustreret i figur 1.<\/li><\/ul>\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-2.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 2: Et enkelt b\u00f8lgel\u00e6ngde spektrofotometer<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Du har brug for et spektrometer til at producere en r\u00e6kke b\u00f8lgel\u00e6ngder, fordi forskellige forbindelser absorberer bedst ved forskellige b\u00f8lgel\u00e6ngder. For eksempel har p-nitrophenol (syreform) den maksimale absorbans ved ca. 320 nm og p-nitrophenolat (basisform) absorberer bedst ved 400 nm, som vist i figur 3.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-3.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 3: Absorbans af to forskellige forbindelser<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n Ser man p\u00e5 grafen, der m\u00e5ler absorbans og b\u00f8lgel\u00e6ngde, kan der ogs\u00e5 observeres et isosbestisk punkt. Et isosbestisk punkt<\/strong> er den b\u00f8lgel\u00e6ngde, hvor absorbansen af to eller flere arter er den samme. Forekomsten af et isosbestisk punkt i en reaktion viser, at der IKKE kr\u00e6ves et mellemprodukt for at danne et produkt ud fra en reaktant. Figur 4 viser et eksempel p\u00e5 et isosbestisk punkt.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-4.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 4: Et eksempel p\u00e5 isosbestisk punkt (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure>\n Med henvisning tilbage til figur 1 (og figur 5), er m\u00e6ngden af fotoner, der g\u00e5r gennem kuvetten og ind i detektoren, afh\u00e6ngig af kuvettens l\u00e6ngde og koncentrationen af pr\u00f8ven. N\u00e5r du kender intensiteten af lys, efter at det passerer gennem kuvetten, kan du relatere det til transmittans (T). Transmittans er den del af lys, der passerer gennem pr\u00f8ven. Dette kan beregnes ved hj\u00e6lp af ligningen:<\/p>\n\n
\\(Transmittans (T) = \\dfrac{I_t}{I_o} \\)<\/p>\n\n
Hvor I t<\/sub> er lysintensiteten efter at lysstr\u00e5len passerer gennem kuvetten og I o<\/sub> er lysintensiteten f\u00f8r lysstr\u00e5len passerer gennem kuvetten. Transmittans er relateret til absorption ved udtrykket:<\/p>\n\n
\\(Absorbans (A) = – log(T) = – log(\\dfrac{I_t}{I_o} )\\)<\/p>\n\n
Hvor absorbans st\u00e5r for m\u00e6ngden af fotoner, der absorberes. Med m\u00e6ngden af absorbans kendt fra ovenst\u00e5ende ligning, kan du bestemme den ukendte koncentration af pr\u00f8ven ved at bruge Beer-Lambert Law. Figur 5 illustrerer transmittans af lys gennem en pr\u00f8ve. L\u00e6ngden \\(l\\) bruges til Beer-Lambert Law beskrevet nedenfor.<\/p>\n\n
![\"\"](\"\/\/i0.wp.com\/qvarz.com\/wp-content\/uploads\/2022\/02\/spectrometry-5.png\" "\\"\\"")
<\/a>Figur 5: Transmittans (CC BY-4.0; Heesung Shim via LibreTexts)<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n \u00d8l-Lambert lov<\/h2>\n\n
Beer-Lambert Law<\/a> (ogs\u00e5 kendt som Beers lov) siger, at der er et line\u00e6rt forhold mellem absorbansen og koncentrationen af en pr\u00f8ve. Af denne grund kan Beers lov kun<\/em> anvendes, n\u00e5r der er en line\u00e6r sammenh\u00e6ng. \u00d8ls lov er skrevet som:<\/p>\n\n
\\(A = \\epsilon{lc} \\)<\/p>\n\n
hvor<\/p>\n\n
- \\(A\\) er m\u00e5let for absorbans (ingen enheder),<\/li>
- \\(\\epsilon\\) er den mol\u00e6re ekstinktionskoefficient eller mol\u00e6re absorptionsevne (eller absorptionskoefficient),<\/li>
- \\(l\\) er stiens l\u00e6ngde, og<\/li>
- \\(c\\) er koncentrationen.<\/li><\/ul>\n
Den mol\u00e6re ekstinktionskoefficient er angivet som en konstant og varierer for hvert molekyle. Da absorbans ikke b\u00e6rer nogen enheder, skal enhederne for \\(\\epsilon\\) udligne l\u00e6ngde- og koncentrationsenhederne. Som et resultat har \\(\\epsilon\\) enhederne: L\u00b7mol -1<\/sup> \u00b7cm -1<\/sup> . Vejl\u00e6ngden m\u00e5les i centimeter. Fordi et standardspektrometer bruger en kuvette, der er 1 cm i bredden, antages \\(l\\) altid at v\u00e6re lig med 1 cm. Da absorption, \\(\\epsilon\\) og vejl\u00e6ngde er kendt, kan vi beregne koncentrationen \\(c\\) af pr\u00f8ven.<\/p>\n\n
Eksempel 1<\/strong><\/p>\n\n
Guanosin<\/a> har en maksimal absorbans p\u00e5 275 nm. \\(\\epsilon_{275} = 8400 M^{-1} cm^{-1} \\) og stiens l\u00e6ngde er 1 cm. Ved hj\u00e6lp af et spektrofotometer finder du, at \\(A_{275} = 0,70\\). Hvad er koncentrationen af guanosin?<\/p>\n\n
Opl\u00f8sning<\/strong><\/p>\n\n
For at l\u00f8se dette problem skal du bruge Beers lov.<\/p>\n\n
\\[A lc \/><\/p>\n\n
0,70 = (8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)(\\(c\\))<\/p>\n\n
Derefter divideres begge sider med [(8400 M -1<\/sup> cm -1<\/sup> )(1 cm)]<\/p>\n\n
\\(c\\) = 8,33×10-5<\/sup> mol\/L<\/p>\n\n
Eksempel 2<\/strong><\/p>\n\n
Der er et stof i en opl\u00f8sning (4 g\/liter). Kuvettens l\u00e6ngde er 2 cm og kun 50 % af den bestemte lysstr\u00e5le transmitteres. Hvad er absorptionskoefficienten?<\/p>\n\n
Opl\u00f8sning<\/strong><\/p>\n\n
Ved hj\u00e6lp af Beer-Lambert Law kan vi beregne absorptionskoefficienten. Dermed,<\/p>\n\n
\\(- \\log \\venstre(\\dfrac{I_t}{I_o} \\right) = – \\log(\\dfrac{0,5}{1,0}) = A ={8} \\epsilon\\)<\/p>\n\n
S\u00e5 f\u00e5r vi det<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376<\/p>\n\n
Eksempel 3<\/strong><\/p>\n\n
I eksempel 2 ovenfor, hvor meget er lysstr\u00e5len transmitteret, n\u00e5r 8 g\/liter?<\/p>\n\n
Opl\u00f8sning<\/strong><\/p>\n\n
Da vi kender \\(\\epsilon\\), kan vi beregne transmissionen ved hj\u00e6lp af Beer-Lambert Law. Dermed,<\/p>\n\n
\\(\\log(1) – \\log(I_t) = 0 – \\log(I_t)\\) = 0,0376 x 8 x 2 = 0,6016<\/p>\n\n
\\(\\log(I_t)\\) = -0,6016<\/p>\n\n
Derfor er \\(I_t\\) = 0,2503 = 25 %<\/p>\n\n
Eksempel 4<\/strong><\/p>\n\n
I eksempel 2 ovenfor, hvad er den mol\u00e6re absorptionskoefficient, hvis molekylv\u00e6gten er 100?<\/p>\n\n
Opl\u00f8sning<\/strong><\/p>\n\n
Det kan simpelthen opn\u00e5s ved at gange absorptionskoefficienten med molekylv\u00e6gten. Dermed,<\/p>\n\n
\\(\\epsilon\\) = 0,0376 x 100 = 3,76 L\u00b7mol –<\/sup>1<\/sup> \u00b7cm –<\/sup>1<\/sup><\/p>\n\n
Eksempel 5<\/strong><\/p>\n\n
Absorptionskoefficienten for et glykogen-jod-kompleks er 0,20 ved lys p\u00e5 450 nm. Hvad er koncentrationen, n\u00e5r transmissionen er 40 % i en kuvette p\u00e5 2 cm?<\/p>\n\n
Opl\u00f8sning<\/strong><\/p>\n\n
Det kan ogs\u00e5 l\u00f8ses ved hj\u00e6lp af Beer-Lambert Law. Derfor,<\/p>\n\n
\\[- \\log(I_t) = – \\log(0,4) = 0,20 \\ gange c \\ gange 2\\]<\/p>\n\n
S\u00e5 \\(c\\) = 0,9948<\/p>\n\n
Referencer<\/h2>\n\n
- Atkins, Peter og Julio de Paula. Fysisk kemi for biovidenskaberne. New York: Oxford University Press, 2006.<\/li>
- Chang, Raymond. Fysisk kemi for biovidenskaberne. USA: University Science Books, 2005.<\/li>
- Gore, Michael. Spektrofotometri & Spektrofluorimetri. New York: Oxford University Press, 2000.<\/li>
- Price, Nicholas og Dwek, Raymond og Wormald, Mark. Principper og problemer i fysisk kemi for biokemikere. RG Ratcliffe. New York: Oxford University Press, 1997.<\/li>
- Irwin H. Segel, Biochemical Calculations (How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry), 2. udgave, John Wiley & Sons, 1975<\/li>
- http:\/\/www.nist.gov\/pml\/div685\/grp03\/spectrophotometry.cfm<\/a><\/li><\/ol>\n
Bidragydere og tilskrivninger<\/h2>\n\n
- Fotometer<\/strong> : Efter det \u00f8nskede lysb\u00f8lgel\u00e6ngdeomr\u00e5de er passeret gennem opl\u00f8sningen af en pr\u00f8ve i kuvette, registrerer fotometeret m\u00e6ngden af fotoner, der absorberes, og sender derefter et signal til et galvanometer eller et digitalt display, som illustreret i figur 1.<\/li><\/ul>\n